來源：藥渡Cyber
佛羅倫薩大學首次報道了一系列可能用于治療奧沙利鉑引起的神經性病變化合物，這些化合物能夠調節人碳酸酐酶亞型（hCA）以及瞬時受體電位香草素1（TRPV1）活性。所有化合物均對參與此類病理學的主要hCA表現出有效的體外抑制活性，而從中挑選的化合物具有TRPV1中度激動作用。最有效的化合物(R)-12a、(R)-37a和兩種對映異構體(R)-39a、(S)-39b的體内評估發現在神經性病變小鼠模型中均能誘導持久的鎮痛效果，并在給藥後30分鐘發揮最大功效。
圖1.具有CAs抑制和TRPV1激動雙重活性的化合物發現和分子優化過程
基于鉑的化療（即順鉑、卡鉑和奧沙利鉑）用于治療惡性良性腫瘤尤其是晚期轉移性癌症，如結直腸癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌等是有效治療藥物。然而，鉑類藥物在臨床使用過程中存在一定的毒副作用，尤其是劑量限制性毒性、腎毒性、耳毒性、骨髓抑制和神經毒性是人們主要關注的毒副作用，通常會因為毒副作用過大，導緻臨床停止用藥。如周圍神經毒性引起感覺異常或遲鈍，而後轉變為慢性感覺神經毒性。此外，慢性疼痛症狀會嚴重影響生存品質。迄今為止，尚無治療奧沙利鉑引起的神經性病變的有效治療藥物，隻有非甾體類抗炎藥（NSAID）和阿片類藥物能夠減緩疼痛。雖然引起神經性病變的病理生理學機制尚不清楚，但是很多報道認同背根神經節（DRG）神經元發生穩态功能障礙可能誘發神經性病變的原因。
這種假設一緻認為DRG位于中樞神經系統之外，是以不受血腦屏障保護。這種理論有一個重要的證據是接受奧沙利鉑治療的患者，通過奧沙利鉑代謝物（即奧沙利鉑草酸鹽）螯合鈣離子，其瞬時受體電位（TRP）離子通道家族（如TRPM8、TRPV1和TRPA1）中的某些亞型受到幹擾，引起神經性病變症狀。根據這一現象，佛羅倫薩大學開始研究TRPV1這個潛在鎮痛靶點，因為它能通過觸發重要的鈣離子流入而參與傷害性刺激的傳遞。通過刺激TRPV1受體，使TRPV1受體脫敏成為一種疼痛治療的有效政策。此前發現辣椒素或樹膠脂毒素（resiniferatoxin）為TRPV1受體激動劑，文獻報道辣椒素視為“分子手術刀”，會導緻TRPV1離子通道開放時間延長，細胞毒性作用隻明顯影響表達TRPV1的感覺神經元。TRPV1部分激動劑也能有效緩解疼痛。
緩解疼痛的另一類藥物是TRPV1拮抗劑，如Fig1 B中的capsazepine或SB-705498。TRPV1拮抗劑雖然可以逆轉疼痛，但存在高熱和意外燒傷等副作用，是以TRPV1拮抗劑無法進一步開發成藥。神經性病變通常與DRG神經元不受控的細胞内酸化有關，導緻金屬(如鉑)與血紅蛋白形成加合物。在同一篇文獻報道中認為，由于去除主要pH緩沖系統而導緻的不受控pH波動可能會通過抑制碳酸酐酶（CA, EC 4.2.1.1）亞型（即碳酸酐酶II，hCAII）而逆轉。基于Potenzieri等人的開創性研究，佛羅倫薩大學的研究者嘗試通過使用能夠抑制金屬酶并激活TRPV1受體的化合物來幹預神經性病變pH失衡。除了pH影響外，當KCC2在周圍神經損傷中受損時，抑制大量中樞神經系統表達的碳酸酐酶（即II、VII和XII亞型）可能會導緻碳酸氫鹽依賴的GABAA受體的去極化減少。
設計思路
佛羅倫薩大學開始利用SB-705498的強效中樞神經性系統滲透性和TRPV1選擇性拮抗作用作為分子改造起始化合物，基于該化合物引入最少的官能團進行分子優化以獲得具有hCA抑制活性的化合物。
采取的合成政策考慮到：
1、用碳酸酐酶抑制的藥效團如磺酰胺替換SB-705498上的CF3取代基，同時，替換苯環上不同取代基找到同時作用兩個靶點的化合物；
2、研究SB-705498中苯環上的溴換成間位或對位取代，同時用其它取代基團（如NO2或H）考慮替換CF3。最後，考察改造的化合物立體異構體是否對不同碳酸酐酶亞型和TRPV1受體的親和力有影響。
碳酸酐酶抑制劑作用
測試了所有合成的化合物（7a,b-22a,b，24a，25a-b, 35a-46a，37b-40b，43b-46b）hCA亞型I、II、IV、VII、IX和XIII的抑制活性具體情況如表1所示。
碳酸酐酶亞型抑制活性的構效關系如下：
- 化合物7-22a,b對細胞質hCA II抑制活性Ki的範圍從12.1nM到818nM。對hCA I親和力與亞型II類似。化合物13a的效力最低（hCA I的Ki為937.6nM）。亞型I和II觀察到相同的動力學趨勢。值得注意的是，與包含7-22b、25b、37-40b和43-46b的 S-構型相比，所有R-構型對映異構體（7-22a、24a、25a和35-46a）具有更強的抑制活性。其中，化合物7a在兩種碳酸酐酶亞型上的效力均比其S構型對映異構體7b強近10倍。化合物11a（Ki 為37.0nM）的抗hCAI活性比化合物11b（Ki為475.8nM）強13倍。而化合物10a-b、16a,b 和20a,b觀察到兩種對映異構體的相反抑制趨勢。與R構型相比，(S)-10b、(S)-16b和(S)-20b是更有效的hCAI和II抑制劑（即(R)-10b、(R)-16b和(R)-20b）。推測R構型和S構型之間的這種逆轉活性可能是由于CF3取代基。另外，化合物13a,b和17a,b等引入大體積的取代基團消除了手性中心的影響。對于hCA II而言，在苯環上引入磺酰胺取代基系列（35-46），發現磺酰胺在硫脲衍生物37-40a,b的對位或間位取代可以增加R構型對映異構體的效力。此外，當磺酰胺處于對位（如43a和45a）時，脲基衍生物表現出相同的趨勢。
- 化合物對膜蛋白hCA IV的Ki值在微摩範圍内。值得注意的是，用磺酰脲取代脲導緻化合物24a的效力大幅提升至納摩水準（Ki為36.6nM）。在磺酰脲的鄰位引入一個氯原子（25a,b）效力下降20倍。
- 幾乎所有的化合物對腦相關亞型hCA VII都有強烈的抑制活性，Ki在亞納摩水準（12b Ki達到0.9nM）。結果顯示化合物對亞型VII與亞型I和II相比有不同的抑制趨勢，大多數S構型對映異構體比R構型更有效。而用硫脲取代脲的化合物（7a,b和8a,b）觀察到相應對映體的活性翻轉。與S構型（7b，Ki為12.1nM）相比，R構型的7a（Ki為6.6nM）效力高出2倍。相反，硫脲衍生物S構型8b（Ki為2.6nM）顯示出比R構型（8a，Ki為8.6nM）高3倍。鹵素原子鄰位似乎對S構型選擇性至關重要，如衍生物11a,b和21a,b，其選擇性比化合物12a,b高10倍和80倍。化合物37-46中磺酰基的取代位置在對映異構體的選擇性上發揮重要作用。如在間位異構體系列中，R構型相對于S構型的增加選擇性。
- 所有化合物對惡性良性腫瘤相關的hCA IX和XII亞型均有效抑制，并顯示Ki值在1.3nM至971.3nM。對映異構體對兩類亞型的選擇性主要受苯環而不是吡啶環上的取代基影響。如表1所示結果顯示化合物9、14、15、17、18和21的對映異構體在hCAI X和XII之間具有反向選擇性。化合物11a,b和21a,b對hCAIX的效力，用後者的硫脲基取代前者的脲基，導緻S構型選擇性增加（11b比11a活性高13.9倍；21b活性比11a高52.5倍）。而對于hCA XII，R構型抑制活性更高，如化合物21a,b。觀察到化合物 37-46的S構型對映異構體是最佳抑制劑，特别是衍生物38a,b顯示出對映異構體超過100倍的選擇性。
TRPV1實驗
評估了所選的R構型對映異構體7a、9a-16a、18a-22a、24a、35a-46a和S構型對映異構體39b和45b測試調節TRPV1受體活性，具體結果如表2所示。
盡管設計的系列化合物均源自TRPV1拮抗劑SB-705498，但從表2測試的結果說明化合物具有明顯的激動作用。即使很小的化學結構修飾可能導緻TRPV1活性調節中激動-拮抗作用轉換。
如化合物10a，37a，38a，39ab，40a，45a,b和46a表現出中等激動作用，EC50值在3.1nM到74.5μM。多數在吡啶環上引入磺酰胺化合物活性喪失。化合物10a有微弱的激動活性（10a EC50為74.5μM），當化合物12a中引入2位氯取代時，激動活性顯著恢複。相反，當大多數苯環上帶磺酰胺取代基時顯示有激動活性，EC50值在低微摩範圍内，如化合物37a和45b分别為8.0μM和3.1μM。在某些情況下，立體中心的構型并不影響活性或效力，如對映異構體39a和39b的TRPV1 EC50為12.5μM。據報道，(R)-45a和(S)-45b的效力存在構型選擇性，後者的活性是前者的9倍。
X射線晶體結構
為了闡明化合物抑制CA的分子基礎，分别以1.3Å和1.6Å分辨率測定了hCA II與對映異構體(R)-37a和(S)-37b複合物的 X 射線結構（Fig3）。電子密度圖分析（支援資訊（SI）中的圖S1）顯示抑制劑(R)-37a的密度，進入催化裂隙，與配體完全相容。正如預期的那樣，磺酰胺部分直接與鋅離子和Thr199殘基形成氫鍵互相作用，進而顯示出此類抑制劑的典型結合模式。此外，苯磺酰胺部分與Val121和Leu198的側鍊之間建立了典型的疏水互相作用，并有助于增強活性位點内的複合物。(R)-37a硫脲基部分的近端氮原子與Thr200形成水橋。在Leu198和Pro202與主支架的疏水部分之間觀察到有價值的額外疏水互相作用，其負責将整個配體粘附在活性位點的疏水區域内（Fig3 A）。與hCAII結合的第二種抑制劑(S)-37b也揭示了有趣的結構特征（Fig3 B）。首先，觀察到硫脲基部分呈雙構象。
此外，衍生物(S)-37b的尾部也觀察到了有趣的特征。事實上，吡咯烷環的S構型立構中心将該部分移動到Phe131的另一側，與該殘基發生疏水互相作用。(S)-37b尾部的這種不同位置也通過吡啶環的氮與Glu69之間的水橋以及與Ile91的疏水互相作用來穩定。兩種對映體(R)-37a和(S)-37b之間的結構比較（Fig3 C）也揭示了相似的特征，例如典型的苯磺酰胺與催化鋅原子和Thr199的互相作用；另一方面，立體中心能夠影響兩個分子的尾部構象，這兩個分子占據由Phe131殘基劃分的兩個不同的疏水口袋。然而，這種結構多樣性并不顯著影響兩種抑制劑對該亞型的抑制等級。
體内止痛驗證
基于體外獲得的CA和TRPV1譜，佛羅倫薩大學選擇了最合适的化合物來進行奧沙利鉑重複治療引起的神經病理性疼痛的體内小鼠模型。考慮的化合物包括：
(i) (R)-36a和(R)-43a作為缺乏TRPV1活性的有效CA抑制劑；
(ii) (R)-12a和(R)-37a，對兩個靶點均有效；
(iii) 兩種對映異構體(R)-39a和(S)-39b，對CA II和TRPV1顯示出相似的有效性。結果如Fig4所示。評估了口服給藥所選化合物（濃度增加至100mg/kg）後的動物舔潛伏期體内實驗。觀察到與以下情況存在劑量依賴性性：
- 對TRPV1沒有任何活性的化合物(R)-36a和(R)-43a顯示出劑量依賴性有效性在給藥後45分鐘達到峰值，随後效果迅速下降，并在75分鐘時被抑制（如Fig 4所示）。
- (R)-12a和(R)-37a在給藥後30分鐘達到峰值，并且有效長達45分鐘。(R)-37a的效力和活性比(R)-12a更有效。這種效應可能合理地歸因于(R)-37a抑制CA II的效力超過(R)-12a（即10.4倍），也考慮到DRG神經元特别富含這種亞型。
- (R)-39a和(S)-39b在30和100mg/kg時顯著有效，在較高劑量下完全恢複奧沙利鉑過敏。基于兩個對映異構體的CA II和TRPV1體外活性接近（如表1和表2所示），(S)-39a略好可能是由于不同的體内代謝過程。
結論
這是第一次報道了關于雙靶向分子能夠通過同時激活TRPV1和抑制CAs酶來緩解神經性病變的文獻。通過芳香環取代、脲基和硫脲基連接配接體之間的生物等排轉換以及立體中心的引入時對兩個靶标的影響進行了初步SAR分析。合成的化合物組中存在的(R)-或(S)-立體中心似乎對兩個靶标的活性沒有相關影響。特别引人注目的是(R)-37a和(S)-37b（即CA II Ki分别為6.7和4.9nM）的情況，因為它們與CA II共晶結構顯示分子尾部位于活性位點的酶促疏水部分，并占據由Phe131殘基分開的不同亞口袋。
将CA彈頭磺酰胺部分引入TRPV1拮抗劑調節劑SB-705498的方法導緻活性逆轉至中度激動作用。觀察到的分子立體中心對 TRPV1 的體外影響是多種多樣的。如(R)-39a和(S)-39b（即兩種化合物的EC50均為12.5μM）不會引起任何效力變化，而對于化合物45，(S)-構型的激動活性比其相應的(R)-構型（EC50）高9倍。(R)-45和(S)-45分别為29.5和3.1μM。
選擇最有價值的體外表現化合物（即(R)-12a、(R)-36a、(R)-37a、(R)-39a、(S)-39b和(R)-43a）探索它們對OINP體内小鼠模型。所有具有CAII或TRPV1活性的化合物均能誘導持久的鎮痛效果，并在給藥後30分鐘發揮最大功效。相反，僅具有針對CA的活性的化合物(R)-36a和(R)-43報道了中等和較短的緩解結果，進而證明了所報告分子的TRPV1激動劑部分對生物模型的重要貢獻。非常有趣的是，對映異構體(R)-39a和(S)-39b在體内模型中誘導生化反應方面明顯不同，前者比其 (S)-構型更有效和持久。同時具有中等活性的TRPV1激動劑和CA強抑制劑的小分子是有效且值得開發的政策，可用于最大限度地減少神經性病變誘發的症狀（如疼痛）。
文章來源
https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.2c01911
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1.藥渡CyberSAR結合藥物設計思想，挖掘了文獻及專利報道的活性的結構，通過CyberSAR以友善快速獲得研發人員興趣靶向結構，以供開拓思路，就TRPV1激動劑舉例如下：
2.在靶點界面選中“化學空間”選項标簽下級聯“聚類結構視圖”頁籤，可以将CyberSAR平台收錄的文獻和專利具有關于TRPV1相關實驗測試活性的分子以“母核結構聚類”的形式展示。其中“綠色字型高亮”的為文獻報道的體外酶、細胞活性測試實驗中EC50<100nM的活性分子結構、具體實驗、實驗結果及實驗來源。
3.在靶點界面選中“化學空間”選項标簽下級聯“原始結構視圖”頁籤，可以将CyberSAR平台收錄的文獻具有關于TRPV1相關實驗測試活性的分子以“研發階段時光軸”的形式展示。其中綠色字型高亮的”資料挖掘“即為潛力Hit。