文|浮生
編輯|浮生
前言
化膿隐秘杆菌是多種家畜及部分野生動物的共生菌，也是一種引起動物乳房炎、膿腫和肺炎的條件性緻病菌，常在動物機體處于不利條件（如受傷、原發性感染和極端天氣等）以及免疫力低下時感染。
人類感染的報道較少見，但免疫功能受損以及接觸感染動物時感染幾率較大，該病原菌無莢膜、無鞭毛、無芽孢，為一種革蘭染色陽性的兼性厭氧短棒狀杆菌，原名化膿不規則杆菌、化膿放線菌，1997年将其劃分至隐秘杆菌屬中，稱為化膿隐秘杆菌。
該菌營養條件要求高，在血瓊脂培養基上生長良好，菌落周圍可産生β-溶血環。化膿隐秘杆菌的緻病性主要由其毒力因子導緻，目前發現的主要毒力基因為編碼外毒素的溶血素plo基因以及促進其黏附宿主細胞的因子基因，包括神經氨酸酶基因、膠原結合蛋白（cbpA）和4個菌毛基因。
化膿隐秘杆菌溶血素作為膽固醇依賴性溶細胞素家族成員之一，也是目前唯一已知的化膿隐秘杆菌外毒素，其對多種宿主細胞具有毒性作用，如紅細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、上皮細胞、成纖維細胞和子宮内膜間質細胞等。
病原菌16SrRNA基因鑒定
将已純化的2株病原菌分别接種至含10%胎牛血清的LB液體培養基，37℃200r/min培養24h後4500r/min低速離心5min收集菌體沉澱。
用無菌生理鹽水調整二者具有相同的OD₆₀₀初始值，取相同體積菌液于含10%胎牛血清的LB液體培養基中，37℃200r/min振蕩培養，每隔2h取200μL菌液測定OD₆₀₀，每株菌各設3組平行對照，培養結束後以OD₆₀₀值繪制2株病原菌的生長曲線。
采用K-B紙片擴散法對病原菌進行藥敏特性檢測。
将收集的菌株沉澱分别用無菌生理鹽水調整至0.5個麥氏比濁度，各取100μL均勻塗布含10%胎牛血清的LB固體培養基，待培養基表面菌液幹燥後按一定順序和距離貼藥敏試紙片，37℃培養後測量抑菌圈直徑大小，并按抗生素類藥敏紙片産品說明書進行藥物敏感性判定。
采用DNAStar6.0軟體比對化膿隐秘杆菌參考菌株基因組，在溶血素plo基因前後較保守區域設計可擴增plo基因全長以及合成7個化膿隐秘杆菌毒力基因nanH、nanP、cbpA、fimA、fimC、fimE和fimG的引物。
其中，plo基因的PCR反應體系參照1.4；PCR反應條件：98℃2min；98℃10s，57℃15s，72℃30s，共35個循環；72℃5min；4℃儲存，其餘基因按文獻[9]方法進行，獲得2株病原菌毒力基因攜帶情況。
病原菌plo基因變異性分析
發病林麝皮下和鴨跗關節的膿腫腔内含黃色黏稠膿液，抽取膿液培養48h後，在10%胎牛血清的LB固體培養基和血瓊脂平闆上均形成光滑濕潤、白色半透明的小菌落，血瓊脂平闆菌落周圍形成界限明顯的透明溶血環，具有β溶血現象，普通LB固體培養基上生長貧瘠，形成針尖大小白色菌落。
對2株化膿隐秘杆菌進行培養發現，化膿隐秘杆菌初次在含血清的培養基中生長繁殖速度較慢，但傳代後其生長繁殖速度可加快。
染色鏡檢均為無芽孢、不規則形狀的革蘭氏陽性短杆菌。生化反應結果顯示2株病原菌半固體培養基均無擴散生長，β-半乳糖苷、葡萄糖試驗均為陽性且均可産氣，尿素、氰化鉀、賴氨酸脫羧酶、甘露醇、山梨醇、乳糖、麥芽糖、蔗糖、西蒙氏檸檬酸鹽、硫化氫、MR、VP試驗均為陰性。
2株病原菌16SrRNA基因序列經BLAST比對顯示，均與化膿隐秘杆菌參考菌株具有較高同源性，以同屬伯納德隐秘杆菌和溶血隐秘杆菌為外源，據Neighbor-Joining法建構系統進化樹發現，2株病原菌與所有化膿隐秘杆菌參考株聚在同一分支上，親緣關系最近。
各取OD₆₀₀初始值為0.34的100μL菌液，加入15mL含10%胎牛血清的LB液體培養基中，37℃200r/min振蕩培養，每隔2h測定OD₆₀₀，以OD₆₀₀平均值繪制2株病原菌的生長曲線。
2株病原菌在0−4h内生長繁殖速度較慢，OD₆₀₀值無明顯變化；4h後鴨源化膿隐秘杆菌生長繁殖速度較林麝源化膿隐秘杆菌快，OD₆₀₀值明顯增大，6h及其之後各檢測時間點二者之間生長繁殖速度差異顯著。
病原菌plo基因變異性分析結果經PCR擴增測序獲得2株病原菌plo基因核苷酸序列全長，均為1605bp，GC含量均為51.40%。
以MEGA7.0建構2株病原菌與GenBank中不同宿主來源的18株化膿隐秘杆菌參考株plo基因系統進化樹發現，不同宿主來源的化膿隐秘杆菌plo基因處于幾個不同獨立分支，本次分離到的林麝源和鴨源化膿隐秘杆菌與羊源參考株聚于同一小分支上，親緣關系最近。
不同宿主來源plo基因核苷酸比對結果發現，plo基因突變率較高，各宿主來源在某些堿基位點具有各自種屬所共有的獨特突變，但均以點突變為主，無插入或缺失。
本次分離的林麝源化膿隐秘杆菌與其他動物源菌株相比，存在3個獨特堿基突變位點為84（G/C）、399（T/G/C）和906（C/T），獨特堿基突變位點較分離的鴨源化膿隐秘杆菌多，推測這些堿基位點可能是其種屬特異性突變位點。
而鴨源化膿隐秘杆菌與親緣關系最近的羊源參考株相比，僅存在一個獨特堿基突變位點為1071（C/T），與羊源參考株具有較高相似性，且林麝源化膿隐秘杆菌在該位點處同樣存在突變，2株病原菌在該位點處還與梅花鹿源參考株獨特突變相同。
PLO二級結構與三級結構預測
經線上軟體SOPMA預測，PLO共存在4種二級結構，含α-螺旋134個（25.09%），β-轉角36個（6.74%）、延伸鍊124個（23.22%）和無規則卷曲240個（44.94%），以無規則卷曲占比最高。
經線上軟體Phyre2預測，獲得溶血素PLO蛋白三級結構，使用拉氏圖對PLO蛋白三級結構預測結果進行分析，結果顯示PLO蛋白91.3%的殘基位于最合理結構區域内，8.0%的殘基位于額外允許區域内，0.5%的殘基位于最大可接受區域内，0.2%的殘基為不可靠區域，最合理結構區域超過90%，預測結果合理性高。
經線上軟體SWISS-MODEL比對，PLO三級結構與鍊球菌溶血素O和單核增生李斯特氏菌溶血素O等CDCs家族成員在大多數結構區域上一緻性較高。
化膿隐秘杆菌是一種重要的接觸性病原體，可在多種動物中引起各種化膿性感染，造成畜牧業重大經濟損失的同時還威脅人類健康。
本研究從雲南宜良地區某林麝特種養殖場發病林麝皮下膿腫液和某種鴨場發病鴨跗關節膿腫液各分離到一株化膿隐秘杆菌，分别命名為FTP-1和DTP-1。
林麝作為國家一級保護動物，雄性林麝香囊的分泌物麝香是傳統名貴中藥材和進階動物香料，具有廣泛的臨床應用和多種藥理作用，經濟價值極高。
發展林麝人工馴養是解決林麝瀕危及麝香可持續生産的有效方式，而化膿性疾病是大陸圈養林麝中發病率最高和危害最嚴重的群發性疾病之一，條件緻病菌化膿隐秘杆菌就是可導緻麝化膿性疾病的其中一種重要病原菌。
目前家禽感染化膿隐秘杆菌報道還較少，本研究從同一地區鴨跗關節膿腫液分離到了化膿隐秘杆菌，推測有該病原體的地區禽類感染率可能增高。
藥物敏感性檢測發現，林麝源化膿隐秘杆菌與鴨源相比，其對林可胺類抗生素具有較強耐藥性，推測這與二者養殖方式不同以及不同養殖方式下用藥習慣不同有關，林麝圈地散養的養殖環境較鴨集約化大規模養殖複雜，環境中緻病菌複雜多樣、用藥雜亂，加大了緻病菌之間耐藥基因轉移整合的機會。
本研究中分離的2株化膿隐秘杆菌耐藥性較其他地區分離株高，如：李俊鋒等在重慶地區分離的梅花鹿源化膿隐秘杆菌僅對氨苄西林和青黴素等4種抗生素耐藥；譚佳等在江西地區分離的豬源化膿隐秘杆菌僅對克林黴素和林可黴素2種抗生素耐藥。
不同地區不同宿主來源耐藥性存在差異，本地區應注意調整用藥，嚴防強耐藥緻病菌株的出現。
Dong等對分離于吉林的27株豬源化膿隐秘杆菌進行耐藥性分析發現，大多數病原菌對氨基糖苷類抗生素耐藥，且發現主要原因為這些耐藥菌株均攜帶有Ⅰ類整合子中的部分耐藥基因，但本次分離到的2株化膿隐秘杆菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥表現均不明顯，或許與2株病原菌尚未含有該類整合系統有關。
結語
本研究分離的2株化膿隐秘杆菌，其plo基因核苷酸與其他來源參考株相比，同樣存在各自的獨特性變異，其中某些位點可能就是其宿主獨特性變異位點，但二者間親緣關系相較其他宿主而言較近，且氨基酸變異相同。
準确預測蛋白結構，立足蛋白結構生物學資訊可有利于研究特異功能基因遺傳本質與調控機理，如藥物和抗體設計開發、研究蛋白間互相作用以及蛋白與其他生物分子間互相作用。
有研究表明，CDCs家族成員之間具有40%−70%的序列相似性，所有成員也都具有相似的三級結構和保守的基本作用機制，本研究預測的化膿隐秘杆菌溶血素PLO結構與其他研究所預測的鍊球菌溶血素SLO和單核增生李斯特氏菌溶血素LLO等CDCs家族成員具有較為相似的蛋白空間構象[25-26]，可有效指導後續該蛋白的結構與功能間關系等相關研究。
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