文|浮生
编辑|浮生
前言
化脓隐秘杆菌是多种家畜及部分野生动物的共生菌，也是一种引起动物乳房炎、脓肿和肺炎的条件性致病菌，常在动物机体处于不利条件（如受伤、原发性感染和极端天气等）以及免疫力低下时感染。
人类感染的报道较少见，但免疫功能受损以及接触感染动物时感染几率较大，该病原菌无荚膜、无鞭毛、无芽孢，为一种革兰染色阳性的兼性厌氧短棒状杆菌，原名化脓不规则杆菌、化脓放线菌，1997年将其划分至隐秘杆菌属中，称为化脓隐秘杆菌。
该菌营养条件要求高，在血琼脂培养基上生长良好，菌落周围可产生β-溶血环。化脓隐秘杆菌的致病性主要由其毒力因子导致，目前发现的主要毒力基因为编码外毒素的溶血素plo基因以及促进其黏附宿主细胞的因子基因，包括神经氨酸酶基因、胶原结合蛋白（cbpA）和4个菌毛基因。
化脓隐秘杆菌溶血素作为胆固醇依赖性溶细胞素家族成员之一，也是目前唯一已知的化脓隐秘杆菌外毒素，其对多种宿主细胞具有毒性作用，如红细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、上皮细胞、成纤维细胞和子宫内膜间质细胞等。
病原菌16SrRNA基因鉴定
将已纯化的2株病原菌分别接种至含10%胎牛血清的LB液体培养基，37℃200r/min培养24h后4500r/min低速离心5min收集菌体沉淀。
用无菌生理盐水调整二者具有相同的OD₆₀₀初始值，取相同体积菌液于含10%胎牛血清的LB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养，每隔2h取200μL菌液测定OD₆₀₀，每株菌各设3组平行对照，培养结束后以OD₆₀₀值绘制2株病原菌的生长曲线。
采用K-B纸片扩散法对病原菌进行药敏特性检测。
将收集的菌株沉淀分别用无菌生理盐水调整至0.5个麦氏比浊度，各取100μL均匀涂布含10%胎牛血清的LB固体培养基，待培养基表面菌液干燥后按一定顺序和距离贴药敏试纸片，37℃培养后测量抑菌圈直径大小，并按抗生素类药敏纸片产品说明书进行药物敏感性判定。
采用DNAStar6.0软件比对化脓隐秘杆菌参考菌株基因组，在溶血素plo基因前后较保守区域设计可扩增plo基因全长以及合成7个化脓隐秘杆菌毒力基因nanH、nanP、cbpA、fimA、fimC、fimE和fimG的引物。
其中，plo基因的PCR反应体系参照1.4；PCR反应条件：98℃2min；98℃10s，57℃15s，72℃30s，共35个循环；72℃5min；4℃保存，其余基因按文献[9]方法进行，获得2株病原菌毒力基因携带情况。
病原菌plo基因变异性分析
发病林麝皮下和鸭跗关节的脓肿腔内含黄色黏稠脓液，抽取脓液培养48h后，在10%胎牛血清的LB固体培养基和血琼脂平板上均形成光滑湿润、白色半透明的小菌落，血琼脂平板菌落周围形成界限明显的透明溶血环，具有β溶血现象，普通LB固体培养基上生长贫瘠，形成针尖大小白色菌落。
对2株化脓隐秘杆菌进行培养发现，化脓隐秘杆菌初次在含血清的培养基中生长繁殖速度较慢，但传代后其生长繁殖速度可加快。
染色镜检均为无芽孢、不规则形状的革兰氏阳性短杆菌。生化反应结果显示2株病原菌半固体培养基均无扩散生长，β-半乳糖苷、葡萄糖试验均为阳性且均可产气，尿素、氰化钾、赖氨酸脱羧酶、甘露醇、山梨醇、乳糖、麦芽糖、蔗糖、西蒙氏柠檬酸盐、硫化氢、MR、VP试验均为阴性。
2株病原菌16SrRNA基因序列经BLAST比对显示，均与化脓隐秘杆菌参考菌株具有较高同源性，以同属伯纳德隐秘杆菌和溶血隐秘杆菌为外源，据Neighbor-Joining法构建系统进化树发现，2株病原菌与所有化脓隐秘杆菌参考株聚在同一分支上，亲缘关系最近。
各取OD₆₀₀初始值为0.34的100μL菌液，加入15mL含10%胎牛血清的LB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养，每隔2h测定OD₆₀₀，以OD₆₀₀平均值绘制2株病原菌的生长曲线。
2株病原菌在0−4h内生长繁殖速度较慢，OD₆₀₀值无明显变化；4h后鸭源化脓隐秘杆菌生长繁殖速度较林麝源化脓隐秘杆菌快，OD₆₀₀值明显增大，6h及其之后各检测时间点二者之间生长繁殖速度差异显著。
病原菌plo基因变异性分析结果经PCR扩增测序获得2株病原菌plo基因核苷酸序列全长，均为1605bp，GC含量均为51.40%。
以MEGA7.0构建2株病原菌与GenBank中不同宿主来源的18株化脓隐秘杆菌参考株plo基因系统进化树发现，不同宿主来源的化脓隐秘杆菌plo基因处于几个不同独立分支，本次分离到的林麝源和鸭源化脓隐秘杆菌与羊源参考株聚于同一小分支上，亲缘关系最近。
不同宿主来源plo基因核苷酸比对结果发现，plo基因突变率较高，各宿主来源在某些碱基位点具有各自种属所共有的独特突变，但均以点突变为主，无插入或缺失。
本次分离的林麝源化脓隐秘杆菌与其他动物源菌株相比，存在3个独特碱基突变位点为84（G/C）、399（T/G/C）和906（C/T），独特碱基突变位点较分离的鸭源化脓隐秘杆菌多，推测这些碱基位点可能是其种属特异性突变位点。
而鸭源化脓隐秘杆菌与亲缘关系最近的羊源参考株相比，仅存在一个独特碱基突变位点为1071（C/T），与羊源参考株具有较高相似性，且林麝源化脓隐秘杆菌在该位点处同样存在突变，2株病原菌在该位点处还与梅花鹿源参考株独特突变相同。
PLO二级结构与三级结构预测
经在线软件SOPMA预测，PLO共存在4种二级结构，含α-螺旋134个（25.09%），β-转角36个（6.74%）、延伸链124个（23.22%）和无规则卷曲240个（44.94%），以无规则卷曲占比最高。
经在线软件Phyre2预测，获得溶血素PLO蛋白三级结构，使用拉氏图对PLO蛋白三级结构预测结果进行分析，结果显示PLO蛋白91.3%的残基位于最合理结构区域内，8.0%的残基位于额外允许区域内，0.5%的残基位于最大可接受区域内，0.2%的残基为不可靠区域，最合理结构区域超过90%，预测结果合理性高。
经在线软件SWISS-MODEL比对，PLO三级结构与链球菌溶血素O和单核增生李斯特氏菌溶血素O等CDCs家族成员在大多数结构区域上一致性较高。
化脓隐秘杆菌是一种重要的接触性病原体，可在多种动物中引起各种化脓性感染，造成畜牧业重大经济损失的同时还威胁人类健康。
本研究从云南宜良地区某林麝特种养殖场发病林麝皮下脓肿液和某种鸭场发病鸭跗关节脓肿液各分离到一株化脓隐秘杆菌，分别命名为FTP-1和DTP-1。
林麝作为国家一级保护动物，雄性林麝香囊的分泌物麝香是传统名贵中药材和高级动物香料，具有广泛的临床应用和多种药理作用，经济价值极高。
发展林麝人工驯养是解决林麝濒危及麝香可持续生产的有效方式，而化脓性疾病是大陆圈养林麝中发病率最高和危害最严重的群发性疾病之一，条件致病菌化脓隐秘杆菌就是可导致麝化脓性疾病的其中一种重要病原菌。
目前家禽感染化脓隐秘杆菌报道还较少，本研究从同一地区鸭跗关节脓肿液分离到了化脓隐秘杆菌，推测有该病原体的地区禽类感染率可能增高。
药物敏感性检测发现，林麝源化脓隐秘杆菌与鸭源相比，其对林可胺类抗生素具有较强耐药性，推测这与二者养殖方式不同以及不同养殖方式下用药习惯不同有关，林麝圈地散养的养殖环境较鸭集约化大规模养殖复杂，环境中致病菌复杂多样、用药杂乱，加大了致病菌之间耐药基因转移整合的机会。
本研究中分离的2株化脓隐秘杆菌耐药性较其他地区分离株高，如：李俊锋等在重庆地区分离的梅花鹿源化脓隐秘杆菌仅对氨苄西林和青霉素等4种抗生素耐药；谭佳等在江西地区分离的猪源化脓隐秘杆菌仅对克林霉素和林可霉素2种抗生素耐药。
不同地区不同宿主来源耐药性存在差异，本地区应注意调整用药，严防强耐药致病菌株的出现。
Dong等对分离于吉林的27株猪源化脓隐秘杆菌进行耐药性分析发现，大多数病原菌对氨基糖苷类抗生素耐药，且发现主要原因为这些耐药菌株均携带有Ⅰ类整合子中的部分耐药基因，但本次分离到的2株化脓隐秘杆菌对氨基糖苷类抗生素的耐药表现均不明显，或许与2株病原菌尚未含有该类整合系统有关。
结语
本研究分离的2株化脓隐秘杆菌，其plo基因核苷酸与其他来源参考株相比，同样存在各自的独特性变异，其中某些位点可能就是其宿主独特性变异位点，但二者间亲缘关系相较其他宿主而言较近，且氨基酸变异相同。
准确预测蛋白结构，立足蛋白结构生物学信息可有利于研究特异功能基因遗传本质与调控机理，如药物和抗体设计开发、研究蛋白间相互作用以及蛋白与其他生物分子间相互作用。
有研究表明，CDCs家族成员之间具有40%−70%的序列相似性，所有成员也都具有相似的三级结构和保守的基本作用机制，本研究预测的化脓隐秘杆菌溶血素PLO结构与其他研究所预测的链球菌溶血素SLO和单核增生李斯特氏菌溶血素LLO等CDCs家族成员具有较为相似的蛋白空间构象[25-26]，可有效指导后续该蛋白的结构与功能间关系等相关研究。
参考文献
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