動物源性食品中寄生蟲的檢測——孟氏裂頭蚴

孟氏是曼氏螺旋體的中期幼蟲，宿主後可引起人畜共患寄生蟲病———孟氏病。成蟲生活在狗和貓等捕食者的小腸中。中間宿主主要以青蛙為主，以蛇為主，豬、雞、鴨，人也可被感染。可侵入皮下組織形成皮下結節，也可侵入腹部内髒器官、組織，也可通過橫斷面攻擊胸腔，最有害的是侵入眼睛和中樞神經系統，可造成殘疾甚至危及生命。

1 病原體特征

孟氏長帶狀，柔軟有彈性，乳白色，大小約300mm×0 . 7mm ，頭部蓬松，扁桃體形，頭端腹部平坦，身體前部無吸槽，後腹部各有垂直淺溝。身體是非節性的，但有水準褶皺，随着輪狀皺紋而收縮。

2 流行病學特征

孟氏病已在全世界都有報道，主要分布在北韓、日本和東南亞、美洲、非洲、澳洲和荷蘭，中國已報告 1000 多例病例，大多在東南沿海地區。在孟氏蟲，成年孟山都蚜蟲的生活史中需要三個宿主。最後的宿主主要是貓和狗，第一中間宿主是劍水跳蚤，第二中間宿主主要是青蛙、蛇、鳥和豬。各種脊椎動物可以用作其宿主進行繼承。成蟲寄生蟲在貓、狗等臨終宿主的小腸中，蟲卵用糞便排洩，在水中孵化出約半個月後形成鈎球，鈎球由第一中間宿主劍水蚤吞下後在其血腔内發育出原來的尾巴。蜻蜓吞下劍水跳蚤，原來的尾巴在蜻蜓逐漸發育成青蛙的過程中發育成。孟氏的大多在青蛙、貓、狗等臨終宿主吞食青蛙的肌肉上，随着孟氏的和再生宿主的再續生，孟氏的逐漸發育成腸道中的成年昆蟲。受感染的青蛙被蛇、鳥、豬等不尋常的宿主喂養後，萌萌的不能在小腸中發育成成蟲，而是遷移到它們的腹腔、肌肉和皮下區域繼續生存，是以蛇、鳥、豬等是恢複宿主。人們經常通過吃生的或未煮熟的青蛙肉，或使用青蛙肉來壓碎傷口而感染。

3 危害

孟氏病屬于人畜共患疾病，具有重要的公共衛生意義。青蛙科門動物作為重要的第二中間宿主，青蛙在世界某些地區，特别是東南亞分布廣泛，包括中國在内的許多國家和地區都吃過生的或未煮熟的青蛙肉，或者民間都有利用青蛙肉研究和做外界抗炎藥，為眼睛冷靜排毒的習慣， 人類感染孟氏頭病并不少見。人類感染孟氏主要有兩種方式，第一種是通過皮膚或粘膜侵入的孟氏或質子病，第二種是誤食孟氏的或原代尾巴。Lee等人在南韓719名患有ELISA的成年人的血清中測試了抗開裂頭球菌病抗體，陽性率為3.3%。在24名血清抗體陽性患者中，24人有吃青蛙和喝水的病史，20人有吃生蛇肉的曆史。人群的這些不良習慣導緻孟氏病的流行，世衛組織應予以關注。

孟氏的寄生人體引起孟氏病，其危害遠大于成蟲，其嚴重程度根據移位和居住地而有所不同。人體的常見部位是眼睛，皮膚下的四肢，口腔面部和内髒器官。在這些區域可形成嗜酸性顆粒囊，引起局部腫脹甚至膿腫。氣囊的直徑一般為1~6cm，帶有囊腔，裂頭的腔體可以從1到10以上。

4 國内外動物源性食品的衛生要求

孟氏裂紋肉在加工過程中，肉質檢驗程式均未規定，處理方法主要是高溫處理法和冷凍無害處理法，可使孟氏裂紋肉達到無害化目的。肉類可以在-31至-29攝氏度或-20至-18攝氏度的冷室或冰箱中冷凍24小時後在淺層還是深層組織中殺死。是以，患有孟氏裂谷病的肉可以在出現後進行冷凍無害處理，或制作原料的複制品。如果冷凍器無法進行，可以在高溫下處理，然後出來。如果昆蟲數量過大，應用于工業用途或破壞。

5 檢測方法

5.1 病原體檢測

5.1.1 牲畜檢測

牲畜感染孟氏病後，難以活體診斷，輕度感染時宿主不出現臨床症狀。當嚴重感染孟氏時，在寄生蟲部位（如腹肌、肋骨肌肉等）可見皮炎、水腫、膿液、壞死等局部症狀。

5.1.2 屠宰後的肉類測試

屠宰牲畜後，進行肉類檢測，并通過檢測當地昆蟲進行診斷。孟氏的往往是寄生的，數量一般為 1~7 ，最多可達 10 個，但也發現了一堆寄生條件。大多數寄生蟲在器官表面檢測到，例如皮下脂肪和肌肉松弛的結締組織，闆脂肪和腸膜。同一宿主通常寄生在昆蟲身體的許多部位。在背部，腹部，肩胛骨，胸部，臀部和橫向肌病中也發現了寄生蟲組織。昆蟲體為扁平帶狀乳白色，常彎曲成團塊狀，如脂肪結節，膨脹成棉絲狀，位于腹膜下方往往較為伸展。昆蟲體的大小差異很大，蟲體可達10cm長，最短僅為3.1cm，大多數在30~80cm，昆蟲體寬為0.01~0.5cm，昆蟲體厚為0.1cm。肝髒和腹膜表面的寄生蟲很小，長度僅為3.1至6.2厘米，頭部為白色線。

5.2 血清學檢測

孟氏侵入人體主要引起皮膚或内髒幼蟲遷移，這使得對疾病的診斷有明顯的局限性，特别是對于臨床表現不明顯的輕度感染，早期感染、隐性感染診斷較難，需要綜合血清抗體檢測、流行病學資料、影像學檢測結果做出正确的判斷， 其中抗體陽性是診斷和鑒别診斷的重要依據。在人群中，孟氏病患者往往通過成像方法進行診斷，如 CT 、超聲等技術，常用的免疫診斷方法有 ELISA 、免疫印金标記免疫濾過（點狀免疫金測定法、 DIGFA 法）等。

5.2.1 酶聯免疫吸附測定

日本和南韓已經使用ELISA檢測血清特異性抗體，以幫助診斷男性裂谷病。在疫區，男性隐性感染較多，無症狀，血清抗體檢測能較好反映患病率。齊西良等正常ELISA檢測孟氏裂解感染小鼠和正常大鼠血清特異性抗體，結果顯示敏感性和特異性均為100%，未見與血吸蟲病、蚜蟲、短片貝蟲感染大鼠血清有交叉反應。為了提高孟山都裂解抗體檢測的特異性，Kong等人報道稱，用單克隆抗體親和力斷層掃描純化抗原可以大大提高免疫診斷的特異性。Ishii等人與多種蠕蟲抗原并排檢測，并根據其他蠕蟲抗原和患者的血清反應進行鑒定和診斷。Yeo等應用裂解單克隆抗體建立了具有抗藥性的ELISA檢測患者血清特異性抗體，靈敏度為94.1%（16/17），與正常ELISA相同;西山等已建立化學發光ELISA檢測患者的血清特異性抗體，敏感性和特異性分别達到100%（14/14）和97.6%（41/42），與肥胖蚜蟲、廣切裂裂蚜蟲感染患者血清無交叉反應。一般的酶聯免疫吸附測定操作如下：

（ 1 ）手術切開純種昆明小鼠腹部皮膚 0 . 5cm ，皮下腹膜埋 2 活，縫合皮膚針頭， 45d 後眼窩采血，置于微量離心管中，37°C溫箱儲存 2h ，然後放入4°C冰箱中過夜， 3500r / min 離心 20min ，用滴管吸收上層免疫血清。

（2）抗原制備活裂解液，用生理生理鹽水消毒3~4次，用均質機反複勻漿15min，按均質體積加入約10倍量的0.01%硫柳汞生理鹽水，反複冷凍解凍1周，加消毒玻璃珠振蕩，超聲粉碎10min，4°C以下10000r/min離心30min， 吸收上清液，設定-20°C以節省備用。

（3）操作步驟（1）設定空白控制管、負滑鼠控制管。陽性大鼠管，每個标本做4孔測定，每孔加入裂解抗原5 sg/mL 100 sl，放入4 oC冰箱冷凍100 sl，放入4 oC冰箱冷凍100 sl，放入4 oC冰箱過夜，（4）PBS-Twain-20緩沖液沖洗孔3次，一次3min，（5）每孔加酶标抗體100 sl（濃度1：20）， 放入37°C溫度箱3~6h;(6）PBS-吐溫-20沖洗3次，一次3分鐘;（7）每孔加入酶底物100μL（現已上市），室溫下放置20min，（8）每孔4mol/L硫酸50μL以終止反應。（9）讀取酶聯免疫測定在450nm處的OD值。受感染小鼠血清OD值超過血清OD平均值，比陰性對照小鼠高2.1倍，為陽性。

5.2.2 免疫印記

免疫印迹檢測對孟氏病的早期感染和深部組織寄生蟲病有較好的輔助靶向作用。操作方法如下：

（1）用均質機反複均質15min後，經生理鹽水洗滌3次制備孟氏裂裂皮膚可溶性抗原，按均質體積加入約10倍量的0.01%硫柳汞生理鹽水，反複冷凍解凍1周，加消毒玻璃珠振蕩，超聲粉碎10min， 4°C以下10000r/min離心30min，吸收上清液，設定-20°C備用備用。

（ 2 ）制備孟氏感染兔血清 8 活孟氏，手術後埋在兔大腿内皮下，感染後每 2 周采集一次血液并分離血清。

（3）取分離的抗原SDS-PAGE（12.5%隔膜膠）槽，在恒流40mA的條件下，電泳6h，然後将分離的抗原蛋白的凝膠附着在NC膜上，置于轉印裝置中，經恒流100mA轉印11h。轉移後，将含有抗原蛋白的NC膜用荔春紅染色轉印，證明蛋白質分離和轉移效果有利于進一步的酶聯免疫印迹（ELIB）。ELIB反應條件：各種血清稀釋度為1：100，酶與1：30 HRPGSPA結合，底物着色劑與DAB。具體步驟是指棘球蚴病的免疫印迹檢測方法。

Choi等研究發現，孟氏裂解作為抗原粗提升的血清學檢測與豬觸覺、塵肺等多種寄生蟲有交叉反應，其中塵肺的交叉反應率為80%（8/10），囊性裂解的交叉反應率為42.5%（17/40），這與使用抗原作為孟氏裂解粗抗原的複雜成分有關。據報道，使用孟球蚴病單克隆抗體親和層析純化抗原可以大大提高孟氏裂解病血清學診斷的特異性和敏感性。