动物源性食品中寄生虫的检测——孟氏裂头蚴

孟氏是曼氏螺旋体的中期幼虫，宿主后可引起人畜共患寄生虫病———孟氏病。成虫生活在狗和猫等捕食者的小肠中。中间宿主主要以青蛙为主，以蛇为主，猪、鸡、鸭，人也可被感染。可侵入皮下组织形成皮下结节，也可侵入腹部内脏器官、组织，也可通过横断面攻击胸腔，最有害的是侵入眼睛和中枢神经系统，可造成残疾甚至危及生命。

1 病原体特征

孟氏长带状，柔软有弹性，乳白色，大小约300mm×0 . 7mm ，头部蓬松，扁桃体形，头端腹部平坦，身体前部无吸槽，后腹部各有垂直浅沟。身体是非节性的，但有水平褶皱，随着轮状皱纹而收缩。

2 流行病学特征

孟氏病已在全世界都有报道，主要分布在朝鲜、日本和东南亚、美洲、非洲、澳大利亚和荷兰，中国已报告 1000 多例病例，大多在东南沿海地区。在孟氏虫，成年孟山都蚜虫的生活史中需要三个宿主。最后的宿主主要是猫和狗，第一中间宿主是剑水跳蚤，第二中间宿主主要是青蛙、蛇、鸟和猪。各种脊椎动物可以用作其宿主进行继承。成虫寄生虫在猫、狗等临终宿主的小肠中，虫卵用粪便排泄，在水中孵化出约半个月后形成钩球，钩球由第一中间宿主剑水蚤吞下后在其血腔内发育出原来的尾巴。蜻蜓吞下剑水跳蚤，原来的尾巴在蜻蜓逐渐发育成青蛙的过程中发育成。孟氏的大多在青蛙、猫、狗等临终宿主吞食青蛙的肌肉上，随着孟氏的和再生宿主的再续生，孟氏的逐渐发育成肠道中的成年昆虫。受感染的青蛙被蛇、鸟、猪等不寻常的宿主喂养后，萌萌的不能在小肠中发育成成虫，而是迁移到它们的腹腔、肌肉和皮下区域继续生存，因此蛇、鸟、猪等是恢复宿主。人们经常通过吃生的或未煮熟的青蛙肉，或使用青蛙肉来压碎伤口而感染。

3 危害

孟氏病属于人畜共患疾病，具有重要的公共卫生意义。青蛙科门动物作为重要的第二中间宿主，青蛙在世界某些地区，特别是东南亚分布广泛，包括中国在内的许多国家和地区都吃过生的或未煮熟的青蛙肉，或者民间都有利用青蛙肉研究和做外界抗炎药，为眼睛冷静排毒的习惯， 人类感染孟氏头病并不少见。人类感染孟氏主要有两种方式，第一种是通过皮肤或粘膜侵入的孟氏或质子病，第二种是误食孟氏的或原代尾巴。Lee等人在韩国719名患有ELISA的成年人的血清中测试了抗开裂头球菌病抗体，阳性率为3.3%。在24名血清抗体阳性患者中，24人有吃青蛙和喝水的病史，20人有吃生蛇肉的历史。人群的这些不良习惯导致孟氏病的流行，世卫组织应予以关注。

孟氏的寄生人体引起孟氏病，其危害远大于成虫，其严重程度根据移位和居住地而有所不同。人体的常见部位是眼睛，皮肤下的四肢，口腔面部和内脏器官。在这些区域可形成嗜酸性颗粒囊，引起局部肿胀甚至脓肿。气囊的直径一般为1~6cm，带有囊腔，裂头的腔体可以从1到10以上。

4 国内外动物源性食品的卫生要求

孟氏裂纹肉在加工过程中，肉质检验程序均未规定，处理方法主要是高温处理法和冷冻无害处理法，可使孟氏裂纹肉达到无害化目的。肉类可以在-31至-29摄氏度或-20至-18摄氏度的冷室或冰箱中冷冻24小时后在浅层还是深层组织中杀死。因此，患有孟氏裂谷病的肉可以在出现后进行冷冻无害处理，或制作原料的复制品。如果冷冻器无法进行，可以在高温下处理，然后出来。如果昆虫数量过大，应用于工业用途或破坏。

5 检测方法

5.1 病原体检测

5.1.1 牲畜检测

牲畜感染孟氏病后，难以活体诊断，轻度感染时宿主不出现临床症状。当严重感染孟氏时，在寄生虫部位（如腹肌、肋骨肌肉等）可见皮炎、水肿、脓液、坏死等局部症状。

5.1.2 屠宰后的肉类测试

屠宰牲畜后，进行肉类检测，并通过检测当地昆虫进行诊断。孟氏的往往是寄生的，数量一般为 1~7 ，最多可达 10 个，但也发现了一堆寄生条件。大多数寄生虫在器官表面检测到，例如皮下脂肪和肌肉松弛的结缔组织，板脂肪和肠膜。同一宿主通常寄生在昆虫身体的许多部位。在背部，腹部，肩胛骨，胸部，臀部和横向肌病中也发现了寄生虫组织。昆虫体为扁平带状乳白色，常弯曲成团块状，如脂肪结节，膨胀成棉丝状，位于腹膜下方往往较为伸展。昆虫体的大小差异很大，虫体可达10cm长，最短仅为3.1cm，大多数在30~80cm，昆虫体宽为0.01~0.5cm，昆虫体厚为0.1cm。肝脏和腹膜表面的寄生虫很小，长度仅为3.1至6.2厘米，头部为白色线。

5.2 血清学检测

孟氏侵入人体主要引起皮肤或内脏幼虫迁移，这使得对疾病的诊断有明显的局限性，特别是对于临床表现不明显的轻度感染，早期感染、隐性感染诊断较难，需要综合血清抗体检测、流行病学数据、影像学检测结果做出正确的判断， 其中抗体阳性是诊断和鉴别诊断的重要依据。在人群中，孟氏病患者往往通过成像方法进行诊断，如 CT 、超声等技术，常用的免疫诊断方法有 ELISA 、免疫印金标记免疫滤过（点状免疫金测定法、 DIGFA 法）等。

5.2.1 酶联免疫吸附测定

日本和韩国已经使用ELISA检测血清特异性抗体，以帮助诊断男性裂谷病。在疫区，男性隐性感染较多，无症状，血清抗体检测能较好反映患病率。齐西良等常规ELISA检测孟氏裂解感染小鼠和正常大鼠血清特异性抗体，结果显示敏感性和特异性均为100%，未见与血吸虫病、蚜虫、短片贝虫感染大鼠血清有交叉反应。为了提高孟山都裂解抗体检测的特异性，Kong等人报道称，用单克隆抗体亲和力断层扫描纯化抗原可以大大提高免疫诊断的特异性。Ishii等人与多种蠕虫抗原并排检测，并根据其他蠕虫抗原和患者的血清反应进行鉴定和诊断。Yeo等应用裂解单克隆抗体建立了具有抗药性的ELISA检测患者血清特异性抗体，灵敏度为94.1%（16/17），与常规ELISA相同;西山等已建立化学发光ELISA检测患者的血清特异性抗体，敏感性和特异性分别达到100%（14/14）和97.6%（41/42），与肥胖蚜虫、广切裂裂蚜虫感染患者血清无交叉反应。一般的酶联免疫吸附测定操作如下：

（ 1 ）手术切开纯种昆明小鼠腹部皮肤 0 . 5cm ，皮下腹膜埋 2 活，缝合皮肤针头， 45d 后眼窝采血，置于微量离心管中，37°C温箱储存 2h ，然后放入4°C冰箱中过夜， 3500r / min 离心 20min ，用滴管吸收上层免疫血清。

（2）抗原制备活裂解液，用生理生理盐水消毒3~4次，用均质机反复匀浆15min，按均质体积加入约10倍量的0.01%硫柳汞生理盐水，反复冷冻解冻1周，加消毒玻璃珠振荡，超声粉碎10min，4°C以下10000r/min离心30min， 吸收上清液，设置-20°C以节省备用。

（3）操作步骤（1）设置空白控制管、负鼠标控制管。阳性大鼠管，每个标本做4孔测定，每孔加入裂解抗原5 sg/mL 100 sl，放入4 oC冰箱冷冻100 sl，放入4 oC冰箱冷冻100 sl，放入4 oC冰箱过夜，（4）PBS-Twain-20缓冲液冲洗孔3次，一次3min，（5）每孔加酶标抗体100 sl（浓度1：20）， 放入37°C温度箱3~6h;(6）PBS-吐温-20冲洗3次，一次3分钟;（7）每孔加入酶底物100μL（现已上市），室温下放置20min，（8）每孔4mol/L硫酸50μL以终止反应。（9）读取酶联免疫测定在450nm处的OD值。受感染小鼠血清OD值超过血清OD平均值，比阴性对照小鼠高2.1倍，为阳性。

5.2.2 免疫印记

免疫印迹检测对孟氏病的早期感染和深部组织寄生虫病有较好的辅助靶向作用。操作方法如下：

（1）用均质机反复均质15min后，经生理盐水洗涤3次制备孟氏裂裂皮肤可溶性抗原，按均质体积加入约10倍量的0.01%硫柳汞生理盐水，反复冷冻解冻1周，加消毒玻璃珠振荡，超声粉碎10min， 4°C以下10000r/min离心30min，吸收上清液，设定-20°C备用备用。

（ 2 ）制备孟氏感染兔血清 8 活孟氏，手术后埋在兔大腿内皮下，感染后每 2 周采集一次血液并分离血清。

（3）取分离的抗原SDS-PAGE（12.5%隔膜胶）槽，在恒流40mA的条件下，电泳6h，然后将分离的抗原蛋白的凝胶附着在NC膜上，置于转印装置中，经恒流100mA转印11h。转移后，将含有抗原蛋白的NC膜用荔春红染色转印，证明蛋白质分离和转移效果有利于进一步的酶联免疫印迹（ELIB）。ELIB反应条件：各种血清稀释度为1：100，酶与1：30 HRPGSPA结合，底物着色剂与DAB。具体步骤是指棘球蚴病的免疫印迹检测方法。

Choi等研究发现，孟氏裂解作为抗原粗提升的血清学检测与猪触觉、尘肺等多种寄生虫有交叉反应，其中尘肺的交叉反应率为80%（8/10），囊性裂解的交叉反应率为42.5%（17/40），这与使用抗原作为孟氏裂解粗抗原的复杂成分有关。据报道，使用孟球蚴病单克隆抗体亲和层析纯化抗原可以大大提高孟氏裂解病血清学诊断的特异性和敏感性。