随着生物刺激素市場的進一步繁榮，腐植酸作為其中重要的一環越來越受人關注，而産品檢測報告是大家評價品質好壞的重要标準（注：産品含量不代表産品品質），而市面上存在的不同檢測标準和方法，導緻大家對産品真實的腐植酸含量充滿疑惑。國際上由于檢測技術發展和研究的深入，出現了新的方法逐漸統一的過程，但仍然存在一些國家采取其他方法的現象，導緻了注冊流程上無法統一，給衆多廠商帶來困擾。田本農化20多年來見證了不同國家腐植酸檢測方法的變化，也參與到了一些檢測方法的研究和制定，正好利用此機會将腐植酸的檢測方法做一個梳理，希望解答大家的一些疑惑。
一、腐植酸的研究曆史
當1786年，德國化學家和生物學家Franz Karl Achard 一次從德國的泥炭沼澤中提取腐植酸以來，人們關于腐植酸的來源、檢測的争論就一直未停歇，我們嘗試着回溯這個曆史，并探讨一下檢測最新的發展。
1786年首次報道提取腐植酸，Achard手稿
一直以來人們認為腐植酸來源是土壤，而Achard用堿從土壤中提出腐植酸的辦法是首選方法。而1819年Braconnot,将酸添加到澱粉和蔗糖中，形成了一種黑色沉澱物，看起來像是土壤中提取的腐植酸，人們把這個稱作“人工烏敏素”“artificial ulmin”。從此人們讨論腐植酸來源是多糖，20年後Mulder将纖維素合成了腐植酸，人們進一步确幸了腐植酸來源是多糖。盡管對于腐植酸的來源已經明确，但是關于腐植酸分類的争論仍在進行，由于腐植酸似乎可以無處不在，可以用不同溶劑以不同的比例提卻，同時用不同的方法在各種來源提取到。是以提取物有不同的溶解度、顔色、質地，導緻了各種新的命名産生，是人們花大量的精力在分類而不是特性的研究。
1870年有兩項發現開始讓人們重新讨論腐植酸的來源，首先是其他結構簡單的有機化合物如四氯化碳可以産生看起來像天然腐植酸的深色物質，而糖類和這些化學物質顯然都不能成為腐植酸的前提，人們開始懷疑多糖來源的說法。其次是腐植酸的化學式群組成的研究表明其包含了複雜的成分，除了碳、氫和氧，還有氮、醚、羟基、烷基和呋喃等。從此多糖來源學說開始失寵。于此同時微生物作為新興研究領域被引入腐植酸的研究，人們開始認為腐植酸來源于微生物對木質素的分解而成，盡管中間還有各種研究反對這種說法，直到1938年作為微生物學家的Waksman寫了一本名為“Humus”的暢銷書，他強烈支援腐植酸的形成是木質素的微生物起到了作用，從此木質素來源學說開始占據了主流。
Waksman關于腐植酸的暢銷書 HUMUS
木質素來源有産生了新的争論，腐植酸是芳香族還是脂肪族。因為人們一開始隻在腐植酸中發現了芳香族化合物，直到1957年Shapiro再次嘗試用化學式定義腐植酸（現在來看，這個不太現實），他創造性的引入了色譜，有機溶劑萃取，液相IR等手段來分析腐植酸，他的研究表明腐植酸，至少乙酸乙酯可溶的部分式脂肪族的。然而1966 年 ，Kononova 出版了一本關于腐殖酸的流行書，與之前 Waksman 的書一樣，強烈支援木質素起源理論。随着新的研究技術如KBR顆粒法，分光光度法，以及固體核磁共振的出現，越來越多的實驗表明腐植酸是脂肪族化合物，同時随着Anderson和Russell合成脂肪族腐植酸，Nissenbaum和kaplan發現了來自于海洋的腐植酸，腐植酸脂肪族結構的學說也開始為人們接受。
海洋中的發現腐植酸
1982年支援木質素的起源的團體建立了國際腐殖質協會（IHSS）通過收集标準腐植酸樣品來幫助研究人員消除資料的不确定性。而另一方開始支援腐植酸脂肪族結構的理論。伴随着技術進步和大規模商業化，從此腐植酸的研究開始進入現代化。當然關于腐植酸來源的研究還在繼續。
二、腐植酸的檢測方法演進
最開始人們關心的土壤的有機質，直接用土壤重量減去灰分和水分得出有機質含量。19世紀40年代分光光度的方法開始流行，常用的方法是将腐植酸樣品暴露在光下；将吸收的光量與取自德國礦山的 Sigma-Aldrich 标準化樣品的定量值進行比較。但由于曆史标準物和現在不同，同時不同的樣品内的分子内電荷轉移互相作用是的分析結果差别很大，逐漸被人們放棄。
19世紀60年代開始流行尺寸排除色譜法，一種尺寸排阻凝膠在柱中分離不同分子量大小分子的方法，但由于腐植酸樣品的來源不同，同時腐植酸鹽列聚合物不适合在動态平衡中分離，導緻方法色譜高度不一緻，結果不準确。
另一種影響很大的方法是CDFA法（又稱加利福尼亞方法），該測試由加利福尼亞州農業部開發。它分離了腐植酸和黃腐酸後，撇去黃腐酸，僅測量剩餘的液體，還包括有機灰分含量，因為沒有排除灰分的影響導緻很多灰分多的産品最終腐植酸含量很高，同時由于加利福尼亞州不承認黃腐酸，導緻含有黃腐酸的樣品在标簽上不得不标注較低的腐植酸含量。
現在國際範圍内應用最廣泛的方法是氧化法（重鉻酸鉀）和ISO的方法
重鉻酸鉀氧化法利用測定氧化過程中消耗的氧含量和碳含量的對比，進而計算出總腐植酸的含量，同時可以用pH=1來沉澱出黃腐酸，來測定黃腐酸的含量。須注意的是樣品的開始稱取量和步驟會導緻有些許差距。另外，在不同國家采用的碳系數不一樣，會導緻最終結果有一定的差别。
此為田本農化現在用的檢測方法
2014年Richard T. Lamar發表了一種新的關于腐植酸的檢測方法，随着IHSS和HPTA（腐植酸産品貿易協會）的推動，此方法為CDFA接受，并成為ISO的标準檢測方法。
此方法通過嚴格步驟将腐植酸沉澱分離稱取重量，同時創造性的利用了DAX-8樹脂對疏水性黃腐酸吸取的特性，準确的測量了疏水性黃腐酸的含量。
不過值得注意的是，傳統定義中多糖，氨基糖，氨基酸類作為親水性的黃腐酸測量不出來。同時，由于木質素磺酸産品會破壞DAX-8樹脂，是以在檢測之前先要通過傅裡葉變換紅外光譜法區分木質素和黃腐酸。
三、未來展望
随着技術的發展和行業組織的推動，氧化法和ISO方法逐漸成為主流方法，并且越來越多國家采取ISO的檢測方法。但是ISO方法由于耗時長，檢測成本高，目前在中國實驗室暫未得到推廣。
回顧曆史我們發現随着人們對腐植酸的研究深入和檢測技術的提升，我們能夠更加準确的了解腐植酸。這個過程中少不了無數研究人員的推動和企業的努力，依稀記得多年前我們與沙特客戶一起去沙特農業部解釋重鉻酸鉀氧化法的優勢的下午，陽光燦爛。
參考資料：
1.https://humicacid.wordpress.com/a-history-of-humic-acid-research/
2. Kononova, M.M. Soil Organic Matter, 2nd Eng. ed., Trans. Nowakowski, T.Z. and Newman, A.C.D. (Pergamon, Oxford, UK, 1966).
3.https://humic-substances.org/
4.https://www.humictrade.org/about-hpta/
5.https://www.minerallogic.com/testing-method
6.https://www.cdfa.ca.gov/is/ffldrs/pdfs/HumicAcid.pdf
7.https://www.researchgate.net/publication/315822454_Humic_Acid_Determination_in_some_Compost_and_Fertilizer_Samples
8.https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/03650340.2019.1575511?journalCode=gags20
9.https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25051616/
10.https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:19822:ed-1:v1:en