文|胡叁叔
编辑|胡叁叔
前言
骨缺损是一种常见的疾病，对其进行有效的修复一直是骨科领域的难题。当前，对于骨缺损的治疗，最常用的方式是自体和异体骨两种。
但目前临床上普遍采用的自体骨来源单一、供骨缺损和难以成型等问题，而异体骨髓间充质干细胞具有易感染和易排异等特点，两者都不能很好地适应临床需要。
目前，传统的有机/无机复合支架难以兼顾微孔结构、生物相容性、可降解性、可调控性及机械强度等特点。
如何研制出能模拟人体骨骼结构的新型仿生支架，已成为目前骨组织工程的一个热点问题。
生长因子（BMP-2）是目前发现的BMPs家族中，促成骨活性最高的BMPs。美国FDA已将rhBMP-2（rhBMP-2）批准用于临床。
rhBMP-2是一种低分子，在体内容易被水溶性蛋白酶快速分解，导致BMP-2在体内的半衰期较短，无法维持骨诱导性。
另外，将其以外源蛋白质的形式移植到人体内，在大量使用的情况下，还存在着一定的毒副作用和免疫排斥等问题。
目前国内外学者已研制出不同形式的rhBMP-2缓释系统，但均有不同程度的缺陷。比如，聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物等，它们都具备了骨传导能力以及可降解性。
当它们用作载体的时候，大多数rhBMP-2在种植前期就已经弥散到了组织中，所以它们在最初的分解过程中速度很快。
此外，它们所合成的高分子降解物呈现出酸性，会造成局部酸碱度下降，从而造成局部组织的无菌性炎症和异物反应，从而对新骨形成产生了一定的影响。
转BMP-2基因的成骨细胞能够在一段时期中保持BMP-2的高表达，从而弥补了以上各种缺陷。
本课题组前期将BMP-2基因工程狗BMSCs与磷酸钙骨水泥复合后，将其移植至大面积的骨缺损中，可有效促进大面积骨缺损的愈合。
因此，我们拟通过构建BMP-2的重组慢病毒，将其导入大鼠BMSCs中，实现BMP-2的持续、稳定的表达。
同时，将GFP基因导入到该基因的表达系统中，使其表达的GFP基因能够在体外进行表达，从而实现对GFP基因表达的实时追踪、筛选和富集。
实验材料
昭衍制药（苏州）制药公司生产的SPF型无特异性致病大鼠10只，体重250-280g，6-9周龄。
根据中华人民共和国科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的有关规定，进行了相应的处理。
取6周~9周龄的体质量为250g~280g的大鼠，采用Percoll细胞分离液，使用密度梯度离心法和差速贴壁传代筛选法，分离培养大鼠的BMSCs。
在1500转/分钟的速率下，采用离心机进行15分钟的离心。将3mL的培养基再次悬置，并缓慢添加到装有相同数量Percoll细胞分离物的离心器中，然后以2000r/分钟的转速进行30分钟离心。
采集界面层细胞，用DMEM培养基冲洗2次，在离心之后，抛弃上清液，再与含胎牛血清的DMEM培养基混合。
以4×105个/cm2的比例，将其接种在细胞培养瓶中，再放在CO2体积浓度为5%、温度为37℃、湿度饱和的细胞培养箱中进行培养。培养基的粘附率为90%后，采用胰酶对其进行酶解，然后传代。
选择pHBLV-U6-GFP-PGK-Puro作为质粒的克隆载体。本研究以XhoI/BamHI为研究对象，以BMP-2基因为切入点。
由上海吉凯生物医药技术有限责任公司，完成了对目标基因的质粒构建，序列分析，包装，浓缩和病毒效价检测。
在第一天，用胰腺蛋白酶对该细胞进行消化，并以6x106个/ml至8x106个/ml的浓度在DMEM中进行培养。
将保存完好的3代骨髓间充质干细胞（BMSCs）接种在6孔板上，每个孔洞内5x105个细胞，并在37℃下进行了夜间的体外培养。
第二日，当细胞粘连在一起时，再将其溶解，检测出其病毒效价为5x108TU/mL，摩尔指数为20，然后将20微升的病毒性液体缓缓加入到该细胞中，混合均匀。将其放入培养器中，开始进一步的培养。
在进行逆转录后，用BMP-2引物对其进行扩增。在一根无菌PCR管中，按顺序添加2μL，上游引物2μL，下游引物2μL,PCR缓冲液5μL，Taq聚合酶1μL，并补充足够的去离子水，以达到50μL的总容量。
本项目拟在前期工作基础上，以大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）为研究对象，采用actinβ-actin为内部参考。
BMP-2的胞内表达将稳定的、已经转染和没有转染的BMSCs以1×105个/cm2浓度种植在一个细胞培养瓶中。
当细胞成长到90%的融合度后，再用胰酶对其进行消化，并在所采集的细胞中添加细胞溶质，在4℃下溶质，以12000r/min的速率对其进行离心15min，得到的上清液即为蛋白提取液。
以BMSCs为研究对象，采用双抗体夹心试验，观察其对靶基因的影响。
在96孔平板上涂覆家兔抗人BMP-2抗体，并分别用HRP和GAPDH标记的绵羊抗兔IgG和DAB染色，用酶标记法测定460nm吸收率。
以无表达及无表达的BMSCs为对照，观察其在体外诱导分化中的作用。将这些细胞以每毫升2x103个的浓度接种在5个96孔盘上。
应用MTT方法观察体外培养的BMSCs在体外的生长情况。
把二甲基亚砜添加到每个孔中，使其溶解成晶体。振动机振动10分钟，摇动均匀，在490nm每个孔径上用酶标记法读出吸收。
第3代形态为长梭形的成纤维细胞，在充分的融合后，以螺旋形和放射形的方式成长，并快速的增殖，见图1。
如图2所示，在转染之前，BMP-2的表达是没有任何绿光的，而在转染之后，BMP-2的表达在BMSCs的荧光显微镜下呈现出一种绿光，证明了BMSCs的转染是成功的。
经诱导后的转染，其组织学改变与预想的一致。
在图3中示出了BMP-2mRNA的表达量。RT-PCR检测发现，经基因修饰的骨髓基质金属蛋白酶-2基因的表达量较野生型显著增加。
相比对照组，BMP-2mRNA的表达水平显著高于对照组（P<0.05）。
蛋白印迹结果如图4所示，用家兔抗人BMP-2抗体和GAPDH标记的绵羊抗兔IgG抗体，分别与家兔抗人BMP-2抗体进行了杂交。
结果表明，所制备的重组质粒能在体外形成条带，与所期望的结果相符。相反，非转染组仅检出GAPDH条带，而BMP-2无表达。
用酶标仪读入每孔的吸光度，以标准曲线（见图5）为依据，来计算出在细胞培养上清液中BMP-2目标蛋白的质量浓度。
从图6可以看出，在转染细胞的培养上清液中，BMP-2的质量浓度显著地高于没有转染细胞的（P<0.05）。
我们前期研究发现，在活体线粒体内，丁二酸脱氢酶能将MTT转化为不可溶解的蓝紫晶型，并在活体线粒体内进行沉淀，而死亡细胞则没有这一作用。
二甲基亚磺酸钠可以将细菌中的甲基异构体溶出，用酶标记法可以直接反应细菌在490nm的吸收情况，从而可以用来判断细菌的数目。
在一定的胞体数量下，MTT晶体的生成与胞体数量呈线性关系。从图7中可以看出，经转染组BMSCs的增殖速率，明显高于未经转染组BMSCs和空载体BMSCs（P<0.05）。
尽管BMSCs来源广泛，但是其在体内的比例却很少，为了达到临床的要求，研究者们通常采用体外分离、纯化和放大的方法来提高BMSCs质量。
目前，国际上普遍采用的分离技术有贴壁法、密度梯度离心法和表面分子标志法。
本实验中先用密度梯度离心法分离BMSCs，再采用贴壁筛选分离法对细胞进行纯化，此方法操作简便，可获得大量性能稳定的BMSCs。与常规方法相比，采用遗传学方法进行修复有明显的优越性。
BMP-2是目前研究最为广泛和深入的一种成骨因子。我们前期研究发现：BMP-2基因在BMSCs中具有较高的表达量。MTT法检测BMP-2表达后，BMSCs的生长速率明显提高（P<0.0.05）。
参考文献：
[1]黄俊锋，王大平，何春耒，等《体外构建腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染骨髓间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石的植骨材料》
[2]张纲，卢来春，裘松波，等《rhBMP-2-PLA纳米微球的制备及生物学效应观察》
[3]邱林，金先庆《骨髓间充质干细胞的生物学特性及其临床治疗应用》