文|胡叁叔
編輯|胡叁叔
前言
骨缺損是一種常見的疾病，對其進行有效的修複一直是骨科領域的難題。目前，對于骨缺損的治療，最常用的方式是自體和異體骨兩種。
但目前臨床上普遍采用的自體骨來源單一、供骨缺損和難以成型等問題，而異體骨髓間充質幹細胞具有易感染和易排異等特點，兩者都不能很好地适應臨床需要。
目前，傳統的有機/無機複合支架難以兼顧微孔結構、生物相容性、可降解性、可調控性及機械強度等特點。
如何研制出能模拟人體骨骼結構的新型仿生支架，已成為目前骨組織工程的一個熱點問題。
生長因子（BMP-2）是目前發現的BMPs家族中，促成骨活性最高的BMPs。美國FDA已将rhBMP-2（rhBMP-2）準許用于臨床。
rhBMP-2是一種低分子，在體内容易被水溶性蛋白酶快速分解，導緻BMP-2在體内的半衰期較短，無法維持骨誘導性。
另外，将其以外源蛋白質的形式移植到人體内，在大量使用的情況下，還存在着一定的毒副作用和免疫排斥等問題。
目前國内外學者已研制出不同形式的rhBMP-2緩釋系統，但均有不同程度的缺陷。比如，聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物等，它們都具備了骨傳導能力以及可降解性。
當它們用作載體的時候，大多數rhBMP-2在種植前期就已經彌散到了組織中，是以它們在最初的分解過程中速度很快。
此外，它們所合成的高分子降解物呈現出酸性，會造成局部酸堿度下降，進而造成局部組織的無菌性發炎和異物反應，進而對新骨形成産生了一定的影響。
轉BMP-2基因的成骨細胞能夠在一段時期中保持BMP-2的高表達，進而彌補了以上各種缺陷。
本課題組前期将BMP-2基因工程狗BMSCs與磷酸鈣骨水泥複合後，将其移植至大面積的骨缺損中，可有效促進大面積骨缺損的愈合。
是以，我們拟通過建構BMP-2的重組慢病毒，将其導入大鼠BMSCs中，實作BMP-2的持續、穩定的表達。
同時，将GFP基因導入到該基因的表達系統中，使其表達的GFP基因能夠在體外進行表達，進而實作對GFP基因表達的實時追蹤、篩選和富集。
實驗材料
昭衍制藥（蘇州）制藥公司生産的SPF型無特異性緻病大鼠10隻，體重250-280g，6-9周齡。
根據中華人民共和國科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的有關規定，進行了相應的處理。
取6周~9周齡的體品質為250g~280g的大鼠，采用Percoll細胞分離液，使用密度梯度離心法和差速貼壁傳代篩選法，分離培養大鼠的BMSCs。
在1500轉/分鐘的速率下，采用離心機進行15分鐘的離心。将3mL的培養基再次懸置，并緩慢添加到裝有相同數量Percoll細胞分離物的離心器中，然後以2000r/分鐘的轉速進行30分鐘離心。
采集界面層細胞，用DMEM培養基沖洗2次，在離心之後，抛棄上清液，再與含胎牛血清的DMEM培養基混合。
以4×105個/cm2的比例，将其接種在細胞培養瓶中，再放在CO2體積濃度為5%、溫度為37℃、濕度飽和的細胞培養箱中進行培養。培養基的粘附率為90%後，采用胰酶對其進行酶解，然後傳代。
選擇pHBLV-U6-GFP-PGK-Puro作為質粒的克隆載體。本研究以XhoI/BamHI為研究對象，以BMP-2基因為切入點。
由上海吉凱生物醫藥技術有限責任公司，完成了對目标基因的質粒建構，序列分析，包裝，濃縮和病毒效價檢測。
在第一天，用胰腺蛋白酶對該細胞進行消化，并以6x106個/ml至8x106個/ml的濃度在DMEM中進行培養。
将儲存完好的3代骨髓間充質幹細胞（BMSCs）接種在6孔闆上，每個孔洞内5x105個細胞，并在37℃下進行了夜間的體外培養。
第二日，當細胞粘連在一起時，再将其溶解，檢測出其病毒效價為5x108TU/mL，摩爾指數為20，然後将20微升的病毒性液體緩緩加入到該細胞中，混合均勻。将其放入培養器中，開始進一步的培養。
在進行逆轉錄後，用BMP-2引物對其進行擴增。在一根無菌PCR管中，按順序添加2μL，上遊引物2μL，下遊引物2μL,PCR緩沖液5μL，Taq聚合酶1μL，并補充足夠的去離子水，以達到50μL的總容量。
本項目拟在前期工作基礎上，以大鼠骨髓間充質幹細胞（BMSCs）為研究對象，采用actinβ-actin為内部參考。
BMP-2的胞内表達将穩定的、已經轉染和沒有轉染的BMSCs以1×105個/cm2濃度種植在一個細胞培養瓶中。
當細胞成長到90%的融合度後，再用胰酶對其進行消化，并在所采集的細胞中添加細胞溶質，在4℃下溶質，以12000r/min的速率對其進行離心15min，得到的上清液即為蛋白提取液。
以BMSCs為研究對象，采用雙抗體夾心試驗，觀察其對靶基因的影響。
在96孔平闆上塗覆家兔抗人BMP-2抗體，并分别用HRP和GAPDH标記的綿羊抗兔IgG和DAB染色，用酶标記法測定460nm吸收率。
以無表達及無表達的BMSCs為對照，觀察其在體外誘導分化中的作用。将這些細胞以每毫升2x103個的濃度接種在5個96孔盤上。
應用MTT方法觀察體外培養的BMSCs在體外的生長情況。
把二甲基亞砜添加到每個孔中，使其溶解成晶體。振動機振動10分鐘，搖動均勻，在490nm每個孔徑上用酶标記法讀出吸收。
第3代形态為長梭形的成纖維細胞，在充分的融合後，以螺旋形和放射形的方式成長，并快速的增殖，見圖1。
如圖2所示，在轉染之前，BMP-2的表達是沒有任何綠光的，而在轉染之後，BMP-2的表達在BMSCs的熒光顯微鏡下呈現出一種綠光，證明了BMSCs的轉染是成功的。
經誘導後的轉染，其組織學改變與預想的一緻。
在圖3中示出了BMP-2mRNA的表達量。RT-PCR檢測發現，經基因修飾的骨髓基質金屬蛋白酶-2基因的表達量較野生型顯著增加。
相比對照組，BMP-2mRNA的表達水準顯著高于對照組（P<0.05）。
蛋白印迹結果如圖4所示，用家兔抗人BMP-2抗體和GAPDH标記的綿羊抗兔IgG抗體，分别與家兔抗人BMP-2抗體進行了雜交。
結果表明，所制備的重組質粒能在體外形成條帶，與所期望的結果相符。相反，非轉染組僅檢出GAPDH條帶，而BMP-2無表達。
用酶标儀讀入每孔的吸光度，以标準曲線（見圖5）為依據，來計算出在細胞培養上清液中BMP-2目标蛋白的品質濃度。
從圖6可以看出，在轉染細胞的培養上清液中，BMP-2的品質濃度顯著地高于沒有轉染細胞的（P<0.05）。
我們前期研究發現，在活體線粒體内，丁二酸脫氫酶能将MTT轉化為不可溶解的藍紫晶型，并在活體線粒體内進行沉澱，而死亡細胞則沒有這一作用。
二甲基亞磺酸鈉可以将細菌中的甲基異構體溶出，用酶标記法可以直接反應細菌在490nm的吸收情況，進而可以用來判斷細菌的數目。
在一定的胞體數量下，MTT晶體的生成與胞體數量呈線性關系。從圖7中可以看出，經轉染組BMSCs的增殖速率，明顯高于未經轉染組BMSCs和空載體BMSCs（P<0.05）。
盡管BMSCs來源廣泛，但是其在體内的比例卻很少，為了達到臨床的要求，研究者們通常采用體外分離、純化和放大的方法來提高BMSCs品質。
目前，國際上普遍采用的分離技術有貼壁法、密度梯度離心法和表面分子标志法。
本實驗中先用密度梯度離心法分離BMSCs，再采用貼壁篩選分離法對細胞進行純化，此方法操作簡便，可獲得大量性能穩定的BMSCs。與正常方法相比，采用遺傳學方法進行修複有明顯的優越性。
BMP-2是目前研究最為廣泛和深入的一種成骨因子。我們前期研究發現：BMP-2基因在BMSCs中具有較高的表達量。MTT法檢測BMP-2表達後，BMSCs的生長速率明顯提高（P<0.0.05）。
參考文獻：
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