HBV慢性感染的建立取決于宿主暴露于病毒時的年齡，特别是免疫功能尚未得到training的新生兒和嬰幼兒。是以圍生産期及嬰幼兒的感染95%以上會慢性化，以緻母嬰垂直傳播成為大陸慢性HBV感染的最主要傳播途徑，大陸的慢性HBV感染也多有典型的高病毒複制、低肝髒發炎為主要組織學特征的免疫耐受期。但随着感染者的年齡增長和免疫的健全，宿主抗病毒免疫特别是T細胞介導的溶細胞作用，通過清除感染肝細胞控制感染。這一方面帶來持續的肝髒發炎損傷，同時也會帶來病毒載量的下降、和免疫選擇壓力下的病毒突變或表觀遺傳修飾改變。在宿主抗病毒與病毒适應性變異的綜合作用推動下，患者的HBV DNA水準進展性地下降、HBeAg陰轉或血清學轉換，但卻鮮見有HBsAg的陰轉。究其原因，與超量HBsAg的長時間持續刺激損耗了抗HBs特異T細胞的功能有關。
随着以HBeAg陰轉為主要血清學标志的cccDNA池衰減和表觀沉默，獨立于HBV複制過程的整合來源的HBsAg的表達和分泌成了慢性B肝（CHB）功能性治愈的最大障礙，如何通過免疫調節恢複或增強宿主抗HBV特别是使功能耗損的抗HBs特異性T細胞活性恢複、以清除功能性表達整合來源HBsAg的肝細胞（集落），正成為人們的關注焦點。一項較為普遍的認知是：HBsAg表達持續的、顯著的下降，不僅有助于解除對功能性抗HBs特異T細胞的耗竭、甚至會部分地恢複和重建。而治愈優勢人群[1]在免疫調節藥物治療下的部分患者達成臨床治愈，更加強化了人們的觀點，即我們或可以通過宿主免疫加持下的直接抗病毒治療來加速cccDNA池的耗竭和HBsAg水準的持續下降，以使抗HBs特異性T細胞功能不再繼續受損甚至部分地恢複，然後再經免疫調節最終使慢B肝患者實作治愈。
2021年，美國Baruch Blumberg研究所的郭巨濤教授帶領我們發表了一篇觀點文章[2]中進一步明确提出，相較于循環血中HBsAg水準的下降，肝組織原位的HBsAg對于宿主抗HBs細胞免疫功能的恢複與重建尤為重要。而這篇來自德國慕尼黑技術大學醫學健康學院病毒研究所Protzer實驗室的文章[3]，題目中就亮出了“HBsAg（表達但）不分泌，既無助于抗病毒 T 細胞反應的誘發，也不促進小鼠體内乙型肝炎病毒的清除”的觀點。作者在結論裡明确表示：清除血液中的 HBsAg 并不能顯著影響AAV-HBV實驗小鼠的 HBV 感染持續、也無助于提升實驗小鼠的HBV特異性 T 細胞免疫。由此作者認為：要打破慢性HBV感染者的對HBV的免疫耐受（更确切地說是使功能障礙(dysfunction)的宿主抗HBV免疫得以恢複），必須限制肝髒病毒抗原的表達。即該文的結論加持了郭巨濤教授的推理。
該團隊在其前期研究中曾用靶向HBV轉錄本共有序列的shRNA或siRNA幹擾，讓模拟了HBV慢性感染的AAV-HBV小鼠肝細胞内包括HBsAg在内的病毒蛋白表達顯著下降。然後再給予治療性疫苗（含HBsAg和HBcAg）（細節請看原文），結果使本來對AAV-HBV呈免疫耐受狀态的部分小鼠實作了血清HBsAg的陰轉。由于在治療性疫苗誘導血清HBsAg陰轉前，RNA幹擾帶來了所有的病毒蛋白抗原下降，到底是哪個（些）病毒蛋白誘發了AAV-HBV小鼠的免疫耐受（感染持續）？具體到HBsAg，到底是循環血内的、還是肝髒原位的HBsAg起到了關鍵的作用呢？在這項後續的實驗中，作者想對HBsAg location 問題有個明斷。在實驗中，作者一是用相對較低感染劑量的AAV-1.3xHBV（genotype D）來更好地使小鼠免疫耐受“感染”，再就是在1.3xHBV的S 基因的ORF引入T193A堿基突變，使HBs的第65位氨基酸發生C/S置換，因為既往已經有研究報導S蛋白的這種C65S突變将引起HBsAg的分泌障礙[4]。下面是該文的實驗結果梗要：
Effect of HBsAg secretion on viral persistence and efficacy of TherVacB in mice expressing low levels of HBV
在用野生和S(C65S) 突變的AAV-1.3xHBV重組病毒感染小鼠四周後，連續給予三針次的TherVacB（治療性疫苗，含HBsAg和HBcAg），的确看到了除了野生之外的小鼠血清中HBsAg的消失和抗-HBs陽轉（A、C）。同樣地，TherVacB治療也帶來了HBeAg的消失和抗-HBe出現（B、D）。值得注意的是，在沒有接受TherVacB治療的情況下，HBV(C65S)小鼠有抗-HBs的出現（C），甚至抗-HBe高出檢測線（D），而這一現象卻未見于HBV(wt)小鼠，提示S基因的C65S突變加速了小鼠清除感染的AAV-HBV。作者用S、Core抗原表位肽刺激使小鼠CD8+T細胞釋放IFNγ、和伴随治療帶來的ALT升高，證明了TherVacB的治療有效性。但與S(C65S)突變加速了小鼠清除感染的AAV-HBV沖突的是，無論是在HBV total RNA水準（H）還是在core蛋白組化染色（I），C65S突變小鼠組卻是部分可低水準檢出的。遺憾作者未提供HBV(C65S)小鼠的HBs肝組化結果，使我們對治療後的肝組織C65S突變的HBsAg仍可檢出？不得而知。
綜合對比野生和HBsAg分泌障礙的S(C65S) 突變小鼠的上述結果，特别是上圖G、F的結果，作者認為僅僅消除循環血中的HBsAg，不會有利于宿主的抗HBs免疫應答。接下來，作者又嘗試了siRNA聯合TherVacB治療，由于俺純粹個人觀點不接受中心法則中的資訊流短時間阻斷會影響到宿主的免疫耐受（如此文中的動物模型）打破，或慢B肝患者dysfunctional的抗HBV特異免疫恢複，這裡其第二部分結果就不展現了。
寫在最後
我知道有不少做B肝相關研究的研究所學生甚至年輕科學家都在關注我們的這個《片警實驗室》公衆号，這裡給你們留兩個思考題：
1. 在慢B肝患者，存在血清HBsAg顯著下降而肝組織HBsAg的表達維持高位的狀态嗎？如果你選yes，何種狀态下會出現？
2. 文獻[4]（doi.org/10.1128/jvi.67.8.4588-4597.1993）描述的essential for secretion of 20-nm particles的Cys-48、Cys-65和Cys-69 的突變，會在慢B肝患者普遍存在嗎？
對于提問1，請一邊思考一邊留意本公衆号，答案即将揭曉，至少to some extent。
最後需要強調的是，該小鼠模型更像是一個抗病毒免疫還沒有完全啟動的免疫耐受狀态，而不是病毒與宿主免疫長時間的互作帶來的宿主抗HBV特異性免疫特别是T細胞功能的耗竭。是以，對于慢性B肝特别是HBeAg陰性慢B肝患者，該政策是否有效？巨濤教授和我共同的看法是——僅能謹慎樂觀。
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參考文獻：
[1]Lu FM, Wang J, Chen XM, et al. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2017;25(2):105-110. doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2017.02.005
[2]Yang S, Zeng W, Zhang J, Lu F, Chang J, Guo JT. Restoration of a functional antiviral immune response to chronic HBV infection by reducing viral antigen load: if not sufficient, is it necessary?. Emerg Microbes Infect. 2021;10(1):1545-1554. doi:10.1080/22221751.2021.1952851
[3]Michler T, Zillinger J, Hagen P, et al. The lack of HBsAg secretion does neither facilitate induction of antiviral T cell responses nor Hepatitis B Virus clearance in mice. Antiviral Res. Published online April 26, 2024. doi:10.1016/j.antiviral.2024.105896
[4]Mangold CM, Streeck RE. Mutational analysis of the cysteine residues in the hepatitis B virus small envelope protein. J Virol. 1993;67(8):4588-4597. doi:10.1128/JVI.67.8.4588-4597.1993
來源：片警實驗室