HBV慢性感染的建立取决于宿主暴露于病毒时的年龄，特别是免疫功能尚未得到training的新生儿和婴幼儿。所以围生产期及婴幼儿的感染95%以上会慢性化，以致母婴垂直传播成为大陆慢性HBV感染的最主要传播途径，大陆的慢性HBV感染也多有典型的高病毒复制、低肝脏炎症为主要组织学特征的免疫耐受期。但随着感染者的年龄增长和免疫的健全，宿主抗病毒免疫特别是T细胞介导的溶细胞作用，通过清除感染肝细胞控制感染。这一方面带来持续的肝脏炎症损伤，同时也会带来病毒载量的下降、和免疫选择压力下的病毒突变或表观遗传修饰改变。在宿主抗病毒与病毒适应性变异的综合作用推动下，患者的HBV DNA水平进展性地下降、HBeAg阴转或血清学转换，但却鲜见有HBsAg的阴转。究其原因，与超量HBsAg的长时间持续刺激损耗了抗HBs特异T细胞的功能有关。
随着以HBeAg阴转为主要血清学标志的cccDNA池衰减和表观沉默，独立于HBV复制过程的整合来源的HBsAg的表达和分泌成了慢性乙肝（CHB）功能性治愈的最大障碍，如何通过免疫调节恢复或增强宿主抗HBV特别是使功能耗损的抗HBs特异性T细胞活性恢复、以清除功能性表达整合来源HBsAg的肝细胞（集落），正成为人们的关注焦点。一项较为普遍的认知是：HBsAg表达持续的、显著的下降，不仅有助于解除对功能性抗HBs特异T细胞的耗竭、甚至会部分地恢复和重建。而治愈优势人群[1]在免疫调节药物治疗下的部分患者达成临床治愈，更加强化了人们的观点，即我们或可以通过宿主免疫加持下的直接抗病毒治疗来加速cccDNA池的耗竭和HBsAg水平的持续下降，以使抗HBs特异性T细胞功能不再继续受损甚至部分地恢复，然后再经免疫调节最终使慢乙肝患者实现治愈。
2021年，美国Baruch Blumberg研究所的郭巨涛教授带领我们发表了一篇观点文章[2]中进一步明确提出，相较于循环血中HBsAg水平的下降，肝组织原位的HBsAg对于宿主抗HBs细胞免疫功能的恢复与重建尤为重要。而这篇来自德国慕尼黑技术大学医学健康学院病毒研究所Protzer实验室的文章[3]，题目中就亮出了“HBsAg（表达但）不分泌，既无助于抗病毒 T 细胞反应的诱发，也不促进小鼠体内乙型肝炎病毒的清除”的观点。作者在结论里明确表示：清除血液中的 HBsAg 并不能显著影响AAV-HBV实验小鼠的 HBV 感染持续、也无助于提升实验小鼠的HBV特异性 T 细胞免疫。由此作者认为：要打破慢性HBV感染者的对HBV的免疫耐受（更确切地说是使功能障碍(dysfunction)的宿主抗HBV免疫得以恢复），必须限制肝脏病毒抗原的表达。即该文的结论加持了郭巨涛教授的推理。
该团队在其前期研究中曾用靶向HBV转录本共有序列的shRNA或siRNA干扰，让模拟了HBV慢性感染的AAV-HBV小鼠肝细胞内包括HBsAg在内的病毒蛋白表达显著下降。然后再给予治疗性疫苗（含HBsAg和HBcAg）（细节请看原文），结果使本来对AAV-HBV呈免疫耐受状态的部分小鼠实现了血清HBsAg的阴转。由于在治疗性疫苗诱导血清HBsAg阴转前，RNA干扰带来了所有的病毒蛋白抗原下降，到底是哪个（些）病毒蛋白诱发了AAV-HBV小鼠的免疫耐受（感染持续）？具体到HBsAg，到底是循环血内的、还是肝脏原位的HBsAg起到了关键的作用呢？在这项后续的实验中，作者想对HBsAg location 问题有个明断。在实验中，作者一是用相对较低感染剂量的AAV-1.3xHBV（genotype D）来更好地使小鼠免疫耐受“感染”，再就是在1.3xHBV的S 基因的ORF引入T193A碱基突变，使HBs的第65位氨基酸发生C/S置换，因为既往已经有研究报导S蛋白的这种C65S突变将引起HBsAg的分泌障碍[4]。下面是该文的实验结果梗要：
Effect of HBsAg secretion on viral persistence and efficacy of TherVacB in mice expressing low levels of HBV
在用野生和S(C65S) 突变的AAV-1.3xHBV重组病毒感染小鼠四周后，连续给予三针次的TherVacB（治疗性疫苗，含HBsAg和HBcAg），的确看到了除了野生之外的小鼠血清中HBsAg的消失和抗-HBs阳转（A、C）。同样地，TherVacB治疗也带来了HBeAg的消失和抗-HBe出现（B、D）。值得注意的是，在没有接受TherVacB治疗的情况下，HBV(C65S)小鼠有抗-HBs的出现（C），甚至抗-HBe高出检测线（D），而这一现象却未见于HBV(wt)小鼠，提示S基因的C65S突变加速了小鼠清除感染的AAV-HBV。作者用S、Core抗原表位肽刺激使小鼠CD8+T细胞释放IFNγ、和伴随治疗带来的ALT升高，证实了TherVacB的治疗有效性。但与S(C65S)突变加速了小鼠清除感染的AAV-HBV矛盾的是，无论是在HBV total RNA水平（H）还是在core蛋白组化染色（I），C65S突变小鼠组却是部分可低水平检出的。遗憾作者未提供HBV(C65S)小鼠的HBs肝组化结果，使我们对治疗后的肝组织C65S突变的HBsAg仍可检出？不得而知。
综合对比野生和HBsAg分泌障碍的S(C65S) 突变小鼠的上述结果，特别是上图G、F的结果，作者认为仅仅消除循环血中的HBsAg，不会有利于宿主的抗HBs免疫应答。接下来，作者又尝试了siRNA联合TherVacB治疗，由于俺纯粹个人观点不接受中心法则中的信息流短时间阻断会影响到宿主的免疫耐受（如此文中的动物模型）打破，或慢乙肝患者dysfunctional的抗HBV特异免疫恢复，这里其第二部分结果就不展现了。
写在最后
我知道有不少做乙肝相关研究的研究生甚至年轻科学家都在关注我们的这个《片警实验室》公众号，这里给你们留两个思考题：
1. 在慢乙肝患者，存在血清HBsAg显著下降而肝组织HBsAg的表达维持高位的状态吗？如果你选yes，何种状态下会出现？
2. 文献[4]（doi.org/10.1128/jvi.67.8.4588-4597.1993）描述的essential for secretion of 20-nm particles的Cys-48、Cys-65和Cys-69 的突变，会在慢乙肝患者普遍存在吗？
对于提问1，请一边思考一边留意本公众号，答案即将揭晓，至少to some extent。
最后需要强调的是，该小鼠模型更像是一个抗病毒免疫还没有完全启动的免疫耐受状态，而不是病毒与宿主免疫长时间的互作带来的宿主抗HBV特异性免疫特别是T细胞功能的耗竭。因此，对于慢性乙肝特别是HBeAg阴性慢乙肝患者，该策略是否有效？巨涛教授和我共同的看法是——仅能谨慎乐观。
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参考文献：
[1]Lu FM, Wang J, Chen XM, et al. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2017;25(2):105-110. doi:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2017.02.005
[2]Yang S, Zeng W, Zhang J, Lu F, Chang J, Guo JT. Restoration of a functional antiviral immune response to chronic HBV infection by reducing viral antigen load: if not sufficient, is it necessary?. Emerg Microbes Infect. 2021;10(1):1545-1554. doi:10.1080/22221751.2021.1952851
[3]Michler T, Zillinger J, Hagen P, et al. The lack of HBsAg secretion does neither facilitate induction of antiviral T cell responses nor Hepatitis B Virus clearance in mice. Antiviral Res. Published online April 26, 2024. doi:10.1016/j.antiviral.2024.105896
[4]Mangold CM, Streeck RE. Mutational analysis of the cysteine residues in the hepatitis B virus small envelope protein. J Virol. 1993;67(8):4588-4597. doi:10.1128/JVI.67.8.4588-4597.1993
来源：片警实验室