近日，國際頂級期刊Nature（《自然》）線上發表了題為“Digital colloid-enhanced Raman spectroscopy by single-molecule counting”的研究論文。該研究針對表面增強拉曼光譜領域内定量的挑戰，系統闡述了基于數字膠體增強拉曼光譜（digital colloid-enhanced Raman spectroscopy, dCERS）的定量技術。基于單分子計數，dCERS成功實作了超低濃度目标分子的可靠定量檢測，為表面增強拉曼光譜技術的普遍應用奠定了重要基礎。
本文的第一作者為上海交通大學生物醫學工程學院緻遠榮譽計劃2020級博士研究所學生畢心緣，通訊作者為葉堅教授。作為資深作者，邵志峰教授在基本概念、資料解析以及文章的凝練、修改等方面做出了關鍵貢獻。Daniel M. Czajkowsky教授也對資料的實體原理與文章修改做出了重要貢獻。上海交通大學是論文的唯一完成機關和通訊機關。
拉曼散射（Raman scattering）是Chandrasekhara Venkata Raman于1928年發現的一種指紋式的、具有分子結構特異性的非彈性散射光譜，并獲得了1930年頒發的諾貝爾實體學獎。通過拉曼譜峰可以直接判斷對應的分子結構，進而識别具體的分子的類型。該技術具有無需标記的優勢，使其在實體、化學、生物、地質、醫學、國防和公共安全等各個領域均具有重要的應用價值。
拉曼信号通常比較弱，是以信号增強就變得非常有必要。表面增強拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS）源于1974年英國南安普敦大學化學系Martin Fleischmann等人的一個重要實驗。他們發現，在粗糙的銀電極表面所附着的吡啶分子所産生的拉曼散射信号會被極大地增強，其實體原理在1977年分别由美國西北大學化學系David L. Jeanmaire和Richard P. Van Duyne以及英國肯特大學化學實驗室M. Grant Albrecht和J. Alan Creighton從電磁場效應和電荷轉移效應做出了解釋。1997年SERS迎來了裡程碑的事件——單分子SERS檢測的實作。自此，SERS技術被認為有希望使得拉曼光譜第二次獲得諾貝爾獎。迄今為止，研究人員開發了各種不同的納米增強基底，如納米星、納米海膽、納米花、納米森林等，通過采用不同的濕化學合成方案與晶片制造技術，使得基底表面具有更為豐富的尖端、縫隙結構，形成更強的熱點區域為其中的分子提供更高的增強能力，實作超低濃度的分子檢測。
但是，随着SERS研究的不斷深入，人們發現在低濃度檢測時，拉曼信号強度存在極大的不可重複性。是以，具有單分子檢測的靈敏度并不意味着超靈敏定量的實作。換言之，獲得更高的增強因子隻是實作SERS高靈敏定量檢測的必要條件，而隻有實作了具有可重複性的測量，SERS技術才具有實際應用與大規模推廣的能力。很顯然，這一困擾拉曼領域幾十年的難題，難以在現有的技術架構中得到圓滿解決。
數字膠體增強拉曼光譜技術概念圖
上海交通大學生物醫學工程學院葉堅教授和邵志峰教授團隊發明了數字膠體增強拉曼光譜（dCERS），利用膠體納米顆粒，可以實作較高效率的單分子檢測。雖然單分子信号強度波動巨大，這與過去的研究結果相吻合，但與常見的單分子SERS技術不同的是，通過将光譜根據是否存在目标分子拉曼特征峰進行0/1數字化，亦即陰性光譜和陽性光譜（數字信号），随後對溶液中的陽性光譜進行計數。通過該單分子計數的方式可以實作對多種分子（如染料分子、代謝小分子、核酸、蛋白）的定量檢測，定量檢測限可以達到1fM以下（圖1）。其中，dCERS技術所采用的膠體顆粒的合成步驟簡單，易于放大生産，在應用中，可以友善地取出每個批次的少量顆粒來針對具體的目标分子預先建立标準曲線，進而可以可靠地用于後續未知濃度樣本的定量。
圖1. dCERS定量檢測原理與不同種類分子的定量标準曲線
在實驗中他們發現，這些通過門檻值确定的單分子事件，其出現次數的分布完全符合泊松統計，是以通過陽性光譜的數量，可以直接簡單地确定定量靈敏度與準确性，這與傳統的基于模拟信号的定量方法完全不同。如圖3所示，通過增加檢測總光譜數，可以累積陽性光譜數量，進而有效提升定量的準确性，定量檢測誤差服從泊松噪聲。是以在真實應用場景下，可以根據分子的檢出機率和對于準确性、檢測總時長等的需求，通過累積陽性光譜數來調控定量檢測的準确性，由此dCERS定量檢測具備精準可控的可重複性。
他們的發現還證明，針對不同的目标分子，盡管濃度與單分子計數的依賴關系具有不同的系數（需要分别進行标定），這些關系都符合吉布斯熱力學的理論。事實上，這是第一次明确建立了單分子統計的實體基礎，并可能适用于拉曼光譜之外的其它單分子計數技術。
為了确立dCERS在實際測量中的潛力，該團隊選取了百草枯和福美雙作為展示執行個體。百草枯是一種高效、劇毒的除草劑，可以誘導帕金森氏病的發生，目前已有32個國家嚴格禁止其使用。福美雙是一種含硫劇毒殺真菌劑，被歐盟歸為二類緻癌物。是以，超高靈敏度的、準确可靠的定量檢測技術對于這些分子的檢測非常重要，尤其是緻癌物，原則上不存在安全劑量。
選取普通的湖水作為背景并混入微量的百草枯，該團隊成功實作了低于歐盟最大殘留量規定三個數量級的檢測靈敏度。對于福美雙，該團隊選取了實驗室培養的豆芽提取液，達到了優于質譜五個數量級的檢測靈敏度。他們證明了，通過系列稀釋的方法，檢測中的背景幹擾可以得到完美的抑制，進而實作準确的靶分子濃度的測量。而dCERS的超高靈敏度和可靠的統計分布是實作這些定量測量的關鍵基礎。
本工作展示了dCERS技術基于單分子計數實作了超低濃度目标分子在未知複雜背景中的可重複性定量，無需使用任何目标分子的特定标記。由于不同的目标分子大多具有獨特的SERS光譜，dCERS可以實作多種不同分子的同時定量檢測，是以具有很好的應用前景。另外，本工作使用的膠體納米顆粒可以友善地進行大規模生産和制備，而檢測方法相對簡單，是以，dCERS有望進一步推動高靈敏檢測技術的變革和進步。
今年剛好是發現SERS技術的50周年，可以預見，随着dCERS技術的進一步成熟，dCERS在生命科學、臨床醫學、環境保護、食品檢測、國防與公共安全以及基礎研究等領域都會得到廣泛的應用。
該工作得到了上海交通大學古宏晨教授、徐宏教授和沈峰教授的幫助，得到了國家自然科學基金委、國家重點研發計劃、上海市科學技術委員會、上海市婦科惡性良性腫瘤重點實驗室、上海交通大學、王寬誠教育基金會的資助。
來源：上海交通大學