今天推送的文章發表在J.Agric.Food Chem.上的“De Novo Biosynthesis of Difucosyllactose by Artificial Pathway Construction and α1,3/4-Fucosyltransferase Rational Design in Escherichia coli”，作者為江南大學的沐萬孟教授。
母乳低聚糖(HMO)是母乳中繼乳糖和脂質之後的第三種主要固體成分，通常分為岩藻糖基化HMO、非岩藻糖基化中性HMO和唾液酸化HMO。2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、二岩藻糖基乳糖(DFL)和乳岩藻糖五糖I(LNFPI)是具有三個、四個和五個單糖單元的代表性岩藻糖基化HMO。DFL可以降低緻病菌粘附在腸道細胞壁上的風險，并可以通過選擇性促進雙歧杆菌等有益細菌的生長來促進腸道健康。目前，很少有研究報道DFL的微生物合成。在這項研究中，作者通過GDP岩藻糖的從頭合成，提出了一種在大腸杆菌中替代且經濟的DFL生産政策。采用組合代謝工程政策，通過平衡和優化GDP-岩藻糖途徑中涉及的四種内源酶來實作DFL的有效合成。為了克服HP3/4FT中的催化活性問題，在Hot-Spot Wizard 3.1伺服器的幫助下設計了計算機輔助修改并進行了實驗測試。然後，作者人為地将所有有益突變體分為三個區域進行理性設計。經過三輪定點突變，獲得了五個突變位點的組合，對應于最佳菌株BLC09-58，能夠顯着提高DFL生物合成。兩種滴度均為迄今為止報道的搖瓶和分批補料水準的最高滴度。
DFL生物合成途徑的從頭設計和建構
由于兩種岩藻糖基轉移酶的受體選擇性較窄，是以選擇WbgL和HP3/4FT，通過外源添加岩藻糖和乳糖作為底物，甘油和葡萄糖作為碳源，在大腸杆菌中依次岩藻糖基化乳糖進行DFL生物合成。在目前的研究中，作為無需提供岩藻糖的替代生物合成途徑，在大腸杆菌中采用從頭GDP-岩藻糖合成途徑，僅補充乳糖即可經濟地生産DFL（圖1）。
具體來說，選擇具有失活競争途徑基因wcaJ（編碼UDP-葡萄糖脂質載體轉移酶）和lacZ（編碼β-半乳糖苷酶）的工程菌株E.coli BL21（DE3）ΔwcaJΔlacZ（BWL）作為後續DFL生物合成的初始菌株（圖2A）。基于之前其他岩藻糖基化HMO生物合成的成功，使用強啟動子PJ23119單獨或協同增強了參與GDP-岩藻糖生物合成的天然基因簇，例如manC-manB和gmd-wcaG（圖2B）。工程菌株用雙質粒和三質粒系統轉化，均由T7啟動子控制（圖2C）。将wbgL基因克隆到pCDFDuet-1中，将HP3/4FT克隆到載體pETDuet-1中。将額外的GDP-岩藻糖生物合成基因manC-manB和gmd-wcaG克隆到第三個載體pRSFDuet-1（表S1）中。所有燒瓶培養均在含有20 g/L甘油和5克/升乳糖。在本研究中，僅測量了細胞外DFL、FL（2'-FL加3-FL）、乳糖和甘油水準。
如圖2D所示，在8個工程菌株的發酵上清液中檢測到了DFL，而DFL和FL的滴度差異較大。總體而言，表達雙質粒系統的四種菌株産生的DFL水準低于表達三種質粒的菌株。盡管菌株BLC02通過原位替換強啟動子而過表達基因簇manC-manB，但BLC01和BLC02産生相似量的DFL，分别對應于0.06和0.07 g/L，并保留相同的FL(0.04 g/L)。這可能表明GDP岩藻糖供應不足；簡單地改善manC-manB基因簇的過度表達會導緻FL和DFL産生水準非常低。相比之下，菌株BLC03僅在菌株BLC01的基礎上過表達基因簇gmd-wcaG，産生1.01g/L的DFL，與野生型菌株BLC01相比明顯增加了16.8倍。與菌株BLC03相比，菌株BLC04在基因組中強化了manC-manB和gmd-wcaG，其DFL滴度略有增加，達到1.05 g/L，同時FL殘留量略有下降（4.11 g/L）。這些結果表明，就GDP-岩藻糖的從頭生物合成而言，基因簇gmd-wcaG的過表達比簡單地強化manC-manB更有效。然而，對應的BLC05∼BLC08均含有三個質粒，并額外添加了質粒pRSF-CBGW，分别産生1.02、1.01、1.25和1.31 g/L的DFL。相應地，FL滴度分别為3.53、3.86、3.29和3.17 g/L。通過對BLC08産生的搖瓶培養物上清液進行LC/MS分析，證明了DFL合成（圖2E）。
乳糖濃度對DFL生物合成的影響
為了驗證假設，通過在1至5 g/L範圍内改變乳糖濃度，研究了乳糖濃度對菌株BLC08産生的DFL和FL滴度和産量的影響。如圖3A所示，乳糖幾乎完全轉化為DFL，僅剩餘微量FL，并且當添加1和2 g/L乳糖時，DFL的産率為0.94 mol/mol消耗的乳糖。然而，随着乳糖濃度的增加，DFL産量逐漸減少，同時FL産量逐漸增加。如圖3B所示，在整個發酵過程中測量了DFL和FL的細胞外濃度，以研究它們在3和5 g/L乳糖條件下濃度變化之間的關聯。在整個發酵過程中，FL的濃度始終高于DFL的濃度，無論乳糖低于3還是5 g/L。菌株BLC08可以在72小時内分别從1.0和2.0 g/L乳糖産生1.75和3.51 g/L DFL，而無需添加岩藻糖。
作者用pCD-fucT2替換質粒pCD-wbgL建構了對應菌株BLC08、BLC09。如圖3C所示，在不同乳糖濃度(1−5 g/L)的培養基中培養的菌株BLC09可有效産生DFL。BLC09産生的DFL濃度從添加1 g/L乳糖時的1.81 g/L逐漸增加至添加5 g/L乳糖時的5.28 g/L。當乳糖濃度小于2 g/L時，BLC09與BLC08的結果相似，而當乳糖濃度大于2 g/L時，這兩種菌株産生的結果完全不同。當乳糖濃度為3、4和5 g/L時，DFL的滴度分别為4.63、4.83和5.28 g/L，每摩爾消耗乳糖的産量分别為0.83、0.78和0.75 mol DFL，相應的至0.81、1.03和1.31 g/L FL，乳糖轉化率逐漸增加。與BLC08的情況類似，在整個發酵過程中檢測到DFL和FL的細胞外濃度。與圖3B中呈現的産物分布相反，無論添加3 g/L還是5 g/L乳糖，菌株BLC09在整個發酵過程中産生的DFL水準高于中間FL（圖3D）。
為了比較WbgL和FucT2對3-FL的底物親和力，使用MD模拟計算和分析了WbgL+3-FL和FucT2+3-FL複合物的結合自由能。如圖4A所示，各系統的結合自由能穩定，FucT2+3-FL的結合自由能始終顯着低于WbgL+3-FL。這可能導緻配體結合的差異，進而導緻對3-FL的偏好。表達FucT2的菌株BLC09使用3-FL作為底物優先産生DFL。FucT2表現出優異的受體底物靈活性，已被證明可以分别使用乳糖、FL和乳糖四糖（LNT）作為受體底物在體内生物合成2'-FL、DFL和LNFPI。LNT的結合自由能略低，對應于較高的LNT偏好，2'-FL的累積量為0.41 g/L，LNFPI的累積量為0.63 g/L。基于上述，建議的DFL生物合成路線如圖4B所示。FucT2岩藻糖基化乳糖生成2′-FL，并在HP3/4FT催化下進一步岩藻糖基化産生DFL。同時，HP3/4FT與FucT2競争乳糖形成3-FL，在FucT2的催化下進一步岩藻糖基化生成DFL。是以，2'-FL和3-FL可以用作受體，分别由HP3/4FT和FucT2催化（圖4B）。
HP3/4FT的計算機輔助篩選和定點突變
作者基于計算機輔助篩選和基于結構的合理設計對HP3/4FT進行了分子修飾。以5ZOI為模闆，使用SWISS-MODEL伺服器進行HP3/4FT的同源模組化（圖S2），并使用HotSpot Wizard伺服器設計第一輪突變。根據突變性和氨基酸頻率預測和選擇位置。最終，鑒定出12個突變并進行了實驗驗證。所有這些突變都位于兩個螺旋上；特别地，R43K、D44K、I46A、H48I、F49K、K52R和Q53E位于靠近N末端的螺旋α2處，而Y128R、H130D、Y131D、A133D和M134E位于螺旋α4處，其屬于N末端結構域（圖5A）。将每個突變插入pETDuet-1并引入宿主BWLCG中以産生一系列BLC09衍生菌株。如圖5B所示，12個突變中有5個産生了比野生型更高水準的DFL，消耗了更多的乳糖，而FL殘基略低于野生型。菌株BLC09-05和BLC09-10各自表達HP3/4FT-F49K和HP3/4FT-Y131D，産生6.05和6.35 g/L DFL，對應于剩餘1.04和1.26 g/L FL。以BLC09-10為例，DFL的産量比BLC09高1.2倍，表明HP3/4FT的Y131D更有利于DFL的催化合成。
基于突變體M32的理性設計和HP3/4FT定點突變
作者發現M32中的七個殘基（S45F、D127N、R128E、H131I）中的四個位于上述兩個螺旋中。是以進一步分析了M32中的7個殘基，重點關注HP3/4FT中的6個平行殘基（A127/Y128/Y131/Y197/E338/R369）。将HP3/4FT中的6個標明殘基突變為A127N、Y128E、Y131I、Y197N、E338D和R369A。随後，将第一輪選擇獲得的有益突變體（F49K和Y131D）與上述基于M32的6個突變體結合起來，将這9個突變體分為三個區域：區域1（殘基38−54）、區域2（殘基124−136）和區域3（殘基197-末端）（圖S3）。選擇位于單個區域的特定殘基進行第二輪突變，其中使用單點和多點組合。如圖6A所示，有益突變體，即F49K、Y131D和Y197N/E338D/R369A，分别位于區域1、2和3，與野生型HP3/4FT相比，各自表現出1.15、1.20和1.25倍的增加。在區域1和區域2的情況下，7個殘基的所有單突變體都顯示出DFL體内生物合成的正向性能，但Y128E除外，其顯示DFL滴度降低了10.5%。不同的突變體組合導緻不同的DFL合成能力，但均低于相應的F49K和Y131D。在區域3的情況下，所有單點和多點組合均顯着增加了DFL滴度，範圍在11.2−25.7%，特别是所有突變點的疊加。
選擇第二輪在指定區域内鑒定的有益突變體進行跨區域重疊突變，進而進行第三輪突變。将兩個區域重疊後，獲得了17個突變體，其中大部分表現出高DFL産量。例如，表達多點突變體F49K/A127N/Y131D（區域1加2）和A127N/Y131D/Y197N/E338D/R369A（區域2加3）的菌株分别産生6.13和7.12 g/L的DFL。最後，将三個區域重疊以找到最佳突變體，所有這些突變體都對DFL産量的顯着改善做出了貢獻。菌株BLC09-58含有名為MH5(F49K/Y131D/Y197N/E338D/R369A)的最佳突變體，其殘基位于區域1、2和3，被鑒定為表現最佳的突變菌株，其DFL生物合成提高了1.37倍（圖6B）。
突變體MH5的結構分析
作為GT-B家族的典型成員，HP3/4FT包含包含殘基1-152的N端結構域(NTD)和以類似羅斯曼折疊為特征的C端結構域(CTD)，跨越殘基153至末端。最好的突變體MH5，其殘基49和131位于NTD，而位置197、338和369位于CTD。突變F49K和Y131D表現出與野生型相似的側鍊特征，靜電勢環境的改變可能會引起結構靈活性的改變，進而導緻生物合成生産的變化（圖7A）。為了進一步分析野生型和突變型MH5産量不同的原因，進行MD模拟以确定結構特征。如圖7B所示，突變體表現出與野生型酶相似的柔性趨勢。然而，NTD組的RMSF值差異顯著。雖然突變F49K位于區域1，突變Y131D位于區域2，但這兩個區域的RMSF值均顯着高于野生型。
通過補料分批發酵示範DFL生物合成
為了綜合評價最佳變異株BLC09-58的發酵擴增性能，在5 L發酵罐、2 L工作體積中進行補料分批發酵。補料分批發酵過程中DFL和FL産生的時間過程如圖8所示。菌株BLC09-58在整個發酵過程中持續産生大量DFL，在發酵結束時達到最大滴度45.81 g/L。相比之下，中間FL的殘留物呈現出截然不同的情況。在發酵早期，即使在44小時内，也沒有觀察到明顯的FL。FL殘留物的滴度在77小時内達到低于2.0 g/L，然後以相對較高的速率增加到83小時時的3.04 g/L。這可能是由于兩種岩藻糖基轉移酶對FL底物的活性降低所緻，也可能是發酵後期部分菌株裂解導緻FL的積累。
DOI：10.1021/acs.jafc.4c01691
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