今天推送的文章发表在J.Agric.Food Chem.上的“De Novo Biosynthesis of Difucosyllactose by Artificial Pathway Construction and α1,3/4-Fucosyltransferase Rational Design in Escherichia coli”，作者为江南大学的沐万孟教授。
母乳低聚糖(HMO)是母乳中继乳糖和脂质之后的第三种主要固体成分，通常分为岩藻糖基化HMO、非岩藻糖基化中性HMO和唾液酸化HMO。2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、二岩藻糖基乳糖(DFL)和乳岩藻糖五糖I(LNFPI)是具有三个、四个和五个单糖单元的代表性岩藻糖基化HMO。DFL可以降低致病菌粘附在肠道细胞壁上的风险，并可以通过选择性促进双歧杆菌等有益细菌的生长来促进肠道健康。目前，很少有研究报道DFL的微生物合成。在这项研究中，作者通过GDP岩藻糖的从头合成，提出了一种在大肠杆菌中替代且经济的DFL生产策略。采用组合代谢工程策略，通过平衡和优化GDP-岩藻糖途径中涉及的四种内源酶来实现DFL的有效合成。为了克服HP3/4FT中的催化活性问题，在Hot-Spot Wizard 3.1服务器的帮助下设计了计算机辅助修改并进行了实验测试。然后，作者人为地将所有有益突变体分为三个区域进行理性设计。经过三轮定点突变，获得了五个突变位点的组合，对应于最佳菌株BLC09-58，能够显着提高DFL生物合成。两种滴度均为迄今为止报道的摇瓶和分批补料水平的最高滴度。
DFL生物合成途径的从头设计和构建
由于两种岩藻糖基转移酶的受体选择性较窄，因此选择WbgL和HP3/4FT，通过外源添加岩藻糖和乳糖作为底物，甘油和葡萄糖作为碳源，在大肠杆菌中依次岩藻糖基化乳糖进行DFL生物合成。在当前的研究中，作为无需提供岩藻糖的替代生物合成途径，在大肠杆菌中采用从头GDP-岩藻糖合成途径，仅补充乳糖即可经济地生产DFL（图1）。
具体来说，选择具有失活竞争途径基因wcaJ（编码UDP-葡萄糖脂质载体转移酶）和lacZ（编码β-半乳糖苷酶）的工程菌株E.coli BL21（DE3）ΔwcaJΔlacZ（BWL）作为后续DFL生物合成的初始菌株（图2A）。基于之前其他岩藻糖基化HMO生物合成的成功，使用强启动子PJ23119单独或协同增强了参与GDP-岩藻糖生物合成的天然基因簇，例如manC-manB和gmd-wcaG（图2B）。工程菌株用双质粒和三质粒系统转化，均由T7启动子控制（图2C）。将wbgL基因克隆到pCDFDuet-1中，将HP3/4FT克隆到载体pETDuet-1中。将额外的GDP-岩藻糖生物合成基因manC-manB和gmd-wcaG克隆到第三个载体pRSFDuet-1（表S1）中。所有烧瓶培养均在含有20 g/L甘油和5克/升乳糖。在本研究中，仅测量了细胞外DFL、FL（2'-FL加3-FL）、乳糖和甘油水平。
如图2D所示，在8个工程菌株的发酵上清液中检测到了DFL，而DFL和FL的滴度差异较大。总体而言，表达双质粒系统的四种菌株产生的DFL水平低于表达三种质粒的菌株。尽管菌株BLC02通过原位替换强启动子而过表达基因簇manC-manB，但BLC01和BLC02产生相似量的DFL，分别对应于0.06和0.07 g/L，并保留相同的FL(0.04 g/L)。这可能表明GDP岩藻糖供应不足；简单地改善manC-manB基因簇的过度表达会导致FL和DFL产生水平非常低。相比之下，菌株BLC03仅在菌株BLC01的基础上过表达基因簇gmd-wcaG，产生1.01g/L的DFL，与野生型菌株BLC01相比明显增加了16.8倍。与菌株BLC03相比，菌株BLC04在基因组中强化了manC-manB和gmd-wcaG，其DFL滴度略有增加，达到1.05 g/L，同时FL残留量略有下降（4.11 g/L）。这些结果表明，就GDP-岩藻糖的从头生物合成而言，基因簇gmd-wcaG的过表达比简单地强化manC-manB更有效。然而，对应的BLC05∼BLC08均含有三个质粒，并额外添加了质粒pRSF-CBGW，分别产生1.02、1.01、1.25和1.31 g/L的DFL。相应地，FL滴度分别为3.53、3.86、3.29和3.17 g/L。通过对BLC08产生的摇瓶培养物上清液进行LC/MS分析，证实了DFL合成（图2E）。
乳糖浓度对DFL生物合成的影响
为了验证假设，通过在1至5 g/L范围内改变乳糖浓度，研究了乳糖浓度对菌株BLC08产生的DFL和FL滴度和产量的影响。如图3A所示，乳糖几乎完全转化为DFL，仅剩余微量FL，并且当添加1和2 g/L乳糖时，DFL的产率为0.94 mol/mol消耗的乳糖。然而，随着乳糖浓度的增加，DFL产量逐渐减少，同时FL产量逐渐增加。如图3B所示，在整个发酵过程中测量了DFL和FL的细胞外浓度，以研究它们在3和5 g/L乳糖条件下浓度变化之间的关联。在整个发酵过程中，FL的浓度始终高于DFL的浓度，无论乳糖低于3还是5 g/L。菌株BLC08可以在72小时内分别从1.0和2.0 g/L乳糖产生1.75和3.51 g/L DFL，而无需添加岩藻糖。
作者用pCD-fucT2替换质粒pCD-wbgL构建了对应菌株BLC08、BLC09。如图3C所示，在不同乳糖浓度(1−5 g/L)的培养基中培养的菌株BLC09可有效产生DFL。BLC09产生的DFL浓度从添加1 g/L乳糖时的1.81 g/L逐渐增加至添加5 g/L乳糖时的5.28 g/L。当乳糖浓度小于2 g/L时，BLC09与BLC08的结果相似，而当乳糖浓度大于2 g/L时，这两种菌株产生的结果完全不同。当乳糖浓度为3、4和5 g/L时，DFL的滴度分别为4.63、4.83和5.28 g/L，每摩尔消耗乳糖的产量分别为0.83、0.78和0.75 mol DFL，相应的至0.81、1.03和1.31 g/L FL，乳糖转化率逐渐增加。与BLC08的情况类似，在整个发酵过程中检测到DFL和FL的细胞外浓度。与图3B中呈现的产物分布相反，无论添加3 g/L还是5 g/L乳糖，菌株BLC09在整个发酵过程中产生的DFL水平高于中间FL（图3D）。
为了比较WbgL和FucT2对3-FL的底物亲和力，使用MD模拟计算和分析了WbgL+3-FL和FucT2+3-FL复合物的结合自由能。如图4A所示，各系统的结合自由能稳定，FucT2+3-FL的结合自由能始终显着低于WbgL+3-FL。这可能导致配体结合的差异，从而导致对3-FL的偏好。表达FucT2的菌株BLC09使用3-FL作为底物优先产生DFL。FucT2表现出优异的受体底物灵活性，已被证实可以分别使用乳糖、FL和乳糖四糖（LNT）作为受体底物在体内生物合成2'-FL、DFL和LNFPI。LNT的结合自由能略低，对应于较高的LNT偏好，2'-FL的累积量为0.41 g/L，LNFPI的累积量为0.63 g/L。基于上述，建议的DFL生物合成路线如图4B所示。FucT2岩藻糖基化乳糖生成2′-FL，并在HP3/4FT催化下进一步岩藻糖基化产生DFL。同时，HP3/4FT与FucT2竞争乳糖形成3-FL，在FucT2的催化下进一步岩藻糖基化生成DFL。因此，2'-FL和3-FL可以用作受体，分别由HP3/4FT和FucT2催化（图4B）。
HP3/4FT的计算机辅助筛选和定点突变
作者基于计算机辅助筛选和基于结构的合理设计对HP3/4FT进行了分子修饰。以5ZOI为模板，使用SWISS-MODEL服务器进行HP3/4FT的同源建模（图S2），并使用HotSpot Wizard服务器设计第一轮突变。根据突变性和氨基酸频率预测和选择位置。最终，鉴定出12个突变并进行了实验验证。所有这些突变都位于两个螺旋上；特别地，R43K、D44K、I46A、H48I、F49K、K52R和Q53E位于靠近N末端的螺旋α2处，而Y128R、H130D、Y131D、A133D和M134E位于螺旋α4处，其属于N末端结构域（图5A）。将每个突变插入pETDuet-1并引入宿主BWLCG中以产生一系列BLC09衍生菌株。如图5B所示，12个突变中有5个产生了比野生型更高水平的DFL，消耗了更多的乳糖，而FL残基略低于野生型。菌株BLC09-05和BLC09-10各自表达HP3/4FT-F49K和HP3/4FT-Y131D，产生6.05和6.35 g/L DFL，对应于剩余1.04和1.26 g/L FL。以BLC09-10为例，DFL的产量比BLC09高1.2倍，表明HP3/4FT的Y131D更有利于DFL的催化合成。
基于突变体M32的理性设计和HP3/4FT定点突变
作者发现M32中的七个残基（S45F、D127N、R128E、H131I）中的四个位于上述两个螺旋中。因此进一步分析了M32中的7个残基，重点关注HP3/4FT中的6个平行残基（A127/Y128/Y131/Y197/E338/R369）。将HP3/4FT中的6个选定残基突变为A127N、Y128E、Y131I、Y197N、E338D和R369A。随后，将第一轮选择获得的有益突变体（F49K和Y131D）与上述基于M32的6个突变体结合起来，将这9个突变体分为三个区域：区域1（残基38−54）、区域2（残基124−136）和区域3（残基197-末端）（图S3）。选择位于单个区域的特定残基进行第二轮突变，其中使用单点和多点组合。如图6A所示，有益突变体，即F49K、Y131D和Y197N/E338D/R369A，分别位于区域1、2和3，与野生型HP3/4FT相比，各自表现出1.15、1.20和1.25倍的增加。在区域1和区域2的情况下，7个残基的所有单突变体都显示出DFL体内生物合成的正向性能，但Y128E除外，其显示DFL滴度降低了10.5%。不同的突变体组合导致不同的DFL合成能力，但均低于相应的F49K和Y131D。在区域3的情况下，所有单点和多点组合均显着增加了DFL滴度，范围在11.2−25.7%，特别是所有突变点的叠加。
选择第二轮在指定区域内鉴定的有益突变体进行跨区域重叠突变，从而进行第三轮突变。将两个区域重叠后，获得了17个突变体，其中大部分表现出高DFL产量。例如，表达多点突变体F49K/A127N/Y131D（区域1加2）和A127N/Y131D/Y197N/E338D/R369A（区域2加3）的菌株分别产生6.13和7.12 g/L的DFL。最后，将三个区域重叠以找到最佳突变体，所有这些突变体都对DFL产量的显着改善做出了贡献。菌株BLC09-58含有名为MH5(F49K/Y131D/Y197N/E338D/R369A)的最佳突变体，其残基位于区域1、2和3，被鉴定为表现最佳的突变菌株，其DFL生物合成提高了1.37倍（图6B）。
突变体MH5的结构分析
作为GT-B家族的典型成员，HP3/4FT包含包含残基1-152的N端结构域(NTD)和以类似罗斯曼折叠为特征的C端结构域(CTD)，跨越残基153至末端。最好的突变体MH5，其残基49和131位于NTD，而位置197、338和369位于CTD。突变F49K和Y131D表现出与野生型相似的侧链特征，静电势环境的改变可能会引起结构灵活性的改变，从而导致生物合成生产的变化（图7A）。为了进一步分析野生型和突变型MH5产量不同的原因，进行MD模拟以确定结构特征。如图7B所示，突变体表现出与野生型酶相似的柔性趋势。然而，NTD组的RMSF值差异显著。虽然突变F49K位于区域1，突变Y131D位于区域2，但这两个区域的RMSF值均显着高于野生型。
通过补料分批发酵演示DFL生物合成
为了综合评价最佳变异株BLC09-58的发酵扩增性能，在5 L发酵罐、2 L工作体积中进行补料分批发酵。补料分批发酵过程中DFL和FL产生的时间过程如图8所示。菌株BLC09-58在整个发酵过程中持续产生大量DFL，在发酵结束时达到最大滴度45.81 g/L。相比之下，中间FL的残留物呈现出截然不同的情况。在发酵早期，即使在44小时内，也没有观察到明显的FL。FL残留物的滴度在77小时内达到低于2.0 g/L，然后以相对较高的速率增加到83小时时的3.04 g/L。这可能是由于两种岩藻糖基转移酶对FL底物的活性降低所致，也可能是发酵后期部分菌株裂解导致FL的积累。
DOI：10.1021/acs.jafc.4c01691
文章链接：https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c01691