作者：洪小巧，耿鵬飛，田娜，李雪媛，高孟秋，聶理會，孫照剛，劉剛
第一作者及機關：洪小巧，清華大學藥學院；耿鵬飛，清華大學藥學院；田娜，首都醫科大學附屬北京胸科醫院
通信作者及機關：劉剛，清華大學藥學院；孫照剛，首都醫科大學附屬北京胸科醫院
From Bench to Clinic: A Nitroreductase Rv3368c-Responsive Cyanine-Based Probe for the Specific Detection of Live Mycobacterium tuberculosis.
Hong X, Geng P, Tian N, Li X, Gao M, Nie L, Sun Z, Liu G.
Analytical chemistry, 2024 Jan 8.
doi:10.1021/acs.analchem.3c04293.
PMID: 38190499.
研究背景
結核病（tuberculosis, TB）是由結核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis, MTB) 引起的一種傳染病，其特點是死亡率高，診斷率低。根據世界衛生組織的統計，2021年全球預計有1060萬例罹患結核病，但僅有640萬例被确診為結核病，結核病的診斷是結核病控制中最薄弱的一環。在結核病高負擔國家，使用金胺O（auramine O, AO）或萋爾-納爾遜（Ziehl-Neelsen）進行痰塗片鏡檢是一線診斷方法，然而，兩種染色劑均與MTB細胞壁中的分枝菌酸結合，無法區分活性和非複制性MTB與死菌，是以，無法反映結核病患者服藥後的治療效果，容易導緻耐藥結核病的發生。此外，兩種方法染色步驟繁瑣，而且AO光穩定性較低，需要快速進行定量測定，導緻敏感度參差不齊。臨床迫切需要開發新一代光穩定性較強的熒光探針，用于快速、簡便地标記活的MTB。由于臨床痰液樣本中存在不同的菌種和複雜的成分，對熒光探針的化學結構穩定性、光學穩定性、特異性及樣本處理穩定性等多方面均有較高的要求，雖然目前已報道了多種MTB新型熒光探針，但多停留在實驗室水準，尚未見到用于臨床抗結核療效評價的報道。
本研究設計合成了一種基于氰基的探針Cy3-NO2-tre。Cy3-NO2-tre自身不發光，但在MTB體内可被特異的硝基還原酶Rv3368c還原後開啟熒光，快速追蹤MTB的感染過程，還能檢測肺結核患者痰液中的MTB。本研究的初步研究結果表明，Cy3-NO2-tre與AO結合使用，可為結核病患者提供一種快速評估藥物療效的方法，并可在患者早期護理階段優化藥物治療方案。
研究方法
本研究首先通過流式細胞儀分析細菌的熒光倍數變化（fluorescence fold change, FFC）确定熒光強度最高的Cy3-NO2-tre為最終熒光試劑，并用Cy3-NO2-tre标記不同種屬混合菌中的MTB驗證其特異性。然後采用Pull down實驗技術鑒定Cy3-NO2-tre作用靶點—Rv3368c，并通過比較Cy3-NO2-tre在Rv3368c基因敲除、回補分枝杆菌菌株内、過表達Rv3368c大腸杆菌DE3的熒光強度進行驗證。然後通過共聚焦顯微鏡對與Cy3-NO2-tre共孵育後感染MTB的細胞進行成像，觀察宿主細胞伸出僞足捕獲MTB的過程。此外，課題組還采用Cy3-NO2-tre與AO檢測臨床痰液樣本中的MTB，并比較其與AO的熒光抗淬滅能力。課題組還将其與AO聯用，監測患者抗藥物治療前與治療1周後痰液中活/死菌比例的變化，初步研究患者服藥治療3個月後的CT結果相關性，監測抗結核治療患者的治療效果。
研究結果
研究結果表明，Cy3-NO2-tre可以選擇性标記不同種屬混合菌中的MTB，而不會對其他細菌産生熒光标記（圖1）。課題組采用Pull down實驗技術鑒定了Cy3-NO2-tre作用靶點—Rv3368c，并通過比較Cy3-NO2-tre在Rv3368c基因敲除、回補分枝杆菌菌株内、過表達Rv3368c大腸杆菌DE3的熒光強度得到驗證（圖2）。基于NCBI的生物資訊學分析結果表明，Rv3368c主要表達于結核分枝杆菌科。
圖1 花菁熒光探針的結構與熒光标記能力
圖2 特異性硝基還原酶RV3368c的探究與驗證
Cy3-NO2-tre可以選擇性标記宿主細胞内的MTB，而不會對宿主細胞産生非特異性标記（圖3）。Cy3-NO2-tre響應較快、免清洗和敏感度高的優點使其能夠實時檢測MTB感染宿主細胞的全過程。課題組利用Cy3-NO2-tre成功地觀察到宿主細胞伸出僞足捕獲MTB的過程，同時也發現某些細菌能夠成功逃脫宿主細胞僞足的“抓捕”，為進一步研究宿主細胞和MTB的互相作用提供了工具分子。
圖3 Cy3-NO2-tre跟蹤MTB與宿主細胞的互相作用
課題組采用Cy3-NO2-tre檢測了臨床痰液樣本中的活MTB。與AO相比，Cy3-NO2-tre表現出顯著更強的熒光抗淬滅能力（圖4）。基于Cy3-NO2-tre隻标記活菌的特性，課題組将其與AO聯用，初步研究了監測結核病患者的抗結核藥物的治療效果。通常，結核病患者需要服藥3個月後再通過CT複查判斷該患者對治療方案的敏感性。采用Cy3-NO2-tre監測患者藥物治療前與治療1周後痰液中活/死菌比例的變化，初步研究了患者服藥治療3個月後的CT結果相關性（圖5），表明Cy3-NO2-tre有可能用于早期監測抗結核藥物的治療效果。
圖4 Cy3-NO2-tre在臨床痰液樣本上的熒光抗淬滅效果強于AO
圖5 Cy3-NO2-tre用于早期評價結核病患者的抗結核治療效果
研究結論
綜上所述，本研究報告了一種對特異性硝基還原酶Rv3368c具有高度響應性的新型熒光探針Cy3-NO2-tre。它可通過結合到細胞壁特異性地強标記MTB，并能快速成像被吞噬的MTB，可作為研究宿主與分枝杆菌互相作用的工具，發現結核病治療的潛在靶點，促進新型抗結核藥物的開發。此外，由于Cy3-NO2-tre具有熒光強度高、本底熒光低、光穩定性好、結構穩定和免洗等特點，它還能以顯著的特異度和敏感度檢測結核病患者痰液中的活MTB。本研究的初步研究結果表明，Cy3-NO2-tre與AO聯用，有可能在早期患者護理階段追蹤抗結核藥物治療方案的療效，但仍需進行大規模的前瞻性臨床調查，進一步研究這種方法與人工智能技術的結合，最終開發出一種快速、準确的療效評估技術。