作者：洪小巧，耿鹏飞，田娜，李雪媛，高孟秋，聂理会，孙照刚，刘刚
第一作者及单位：洪小巧，清华大学药学院；耿鹏飞，清华大学药学院；田娜，首都医科大学附属北京胸科医院
通信作者及单位：刘刚，清华大学药学院；孙照刚，首都医科大学附属北京胸科医院
From Bench to Clinic: A Nitroreductase Rv3368c-Responsive Cyanine-Based Probe for the Specific Detection of Live Mycobacterium tuberculosis.
Hong X, Geng P, Tian N, Li X, Gao M, Nie L, Sun Z, Liu G.
Analytical chemistry, 2024 Jan 8.
doi:10.1021/acs.analchem.3c04293.
PMID: 38190499.
研究背景
结核病（tuberculosis, TB）是由结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis, MTB) 引起的一种传染病，其特点是死亡率高，诊断率低。根据世界卫生组织的统计，2021年全球预计有1060万例罹患结核病，但仅有640万例被确诊为结核病，结核病的诊断是结核病控制中最薄弱的一环。在结核病高负担国家，使用金胺O（auramine O, AO）或萋尔-纳尔逊（Ziehl-Neelsen）进行痰涂片镜检是一线诊断方法，然而，两种染色剂均与MTB细胞壁中的分枝菌酸结合，无法区分活性和非复制性MTB与死菌，因此，无法反映结核病患者服药后的治疗效果，容易导致耐药结核病的发生。此外，两种方法染色步骤繁琐，而且AO光稳定性较低，需要快速进行定量测定，导致敏感度参差不齐。临床迫切需要开发新一代光稳定性较强的荧光探针，用于快速、简便地标记活的MTB。由于临床痰液样本中存在不同的菌种和复杂的成分，对荧光探针的化学结构稳定性、光学稳定性、特异性及样本处理稳定性等多方面均有较高的要求，虽然目前已报道了多种MTB新型荧光探针，但多停留在实验室水平，尚未见到用于临床抗结核疗效评价的报道。
本研究设计合成了一种基于氰基的探针Cy3-NO2-tre。Cy3-NO2-tre自身不发光，但在MTB体内可被特异的硝基还原酶Rv3368c还原后开启荧光，快速追踪MTB的感染过程，还能检测肺结核患者痰液中的MTB。本研究的初步研究结果表明，Cy3-NO2-tre与AO结合使用，可为结核病患者提供一种快速评估药物疗效的方法，并可在患者早期护理阶段优化药物治疗方案。
研究方法
本研究首先通过流式细胞仪分析细菌的荧光倍数变化（fluorescence fold change, FFC）确定荧光强度最高的Cy3-NO2-tre为最终荧光试剂，并用Cy3-NO2-tre标记不同种属混合菌中的MTB验证其特异性。然后采用Pull down实验技术鉴定Cy3-NO2-tre作用靶点—Rv3368c，并通过比较Cy3-NO2-tre在Rv3368c基因敲除、回补分枝杆菌菌株内、过表达Rv3368c大肠杆菌DE3的荧光强度进行验证。然后通过共聚焦显微镜对与Cy3-NO2-tre共孵育后感染MTB的细胞进行成像，观察宿主细胞伸出伪足捕获MTB的过程。此外，课题组还采用Cy3-NO2-tre与AO检测临床痰液样本中的MTB，并比较其与AO的荧光抗淬灭能力。课题组还将其与AO联用，监测患者抗药物治疗前与治疗1周后痰液中活/死菌比例的变化，初步研究患者服药治疗3个月后的CT结果相关性，监测抗结核治疗患者的治疗效果。
研究结果
研究结果表明，Cy3-NO2-tre可以选择性标记不同种属混合菌中的MTB，而不会对其他细菌产生荧光标记（图1）。课题组采用Pull down实验技术鉴定了Cy3-NO2-tre作用靶点—Rv3368c，并通过比较Cy3-NO2-tre在Rv3368c基因敲除、回补分枝杆菌菌株内、过表达Rv3368c大肠杆菌DE3的荧光强度得到验证（图2）。基于NCBI的生物信息学分析结果表明，Rv3368c主要表达于结核分枝杆菌科。
图1 花菁荧光探针的结构与荧光标记能力
图2 特异性硝基还原酶RV3368c的探究与验证
Cy3-NO2-tre可以选择性标记宿主细胞内的MTB，而不会对宿主细胞产生非特异性标记（图3）。Cy3-NO2-tre响应较快、免清洗和敏感度高的优点使其能够实时检测MTB感染宿主细胞的全过程。课题组利用Cy3-NO2-tre成功地观察到宿主细胞伸出伪足捕获MTB的过程，同时也发现某些细菌能够成功逃脱宿主细胞伪足的“抓捕”，为进一步研究宿主细胞和MTB的相互作用提供了工具分子。
图3 Cy3-NO2-tre跟踪MTB与宿主细胞的相互作用
课题组采用Cy3-NO2-tre检测了临床痰液样本中的活MTB。与AO相比，Cy3-NO2-tre表现出显著更强的荧光抗淬灭能力（图4）。基于Cy3-NO2-tre只标记活菌的特性，课题组将其与AO联用，初步研究了监测结核病患者的抗结核药物的治疗效果。通常，结核病患者需要服药3个月后再通过CT复查判断该患者对治疗方案的敏感性。采用Cy3-NO2-tre监测患者药物治疗前与治疗1周后痰液中活/死菌比例的变化，初步研究了患者服药治疗3个月后的CT结果相关性（图5），表明Cy3-NO2-tre有可能用于早期监测抗结核药物的治疗效果。
图4 Cy3-NO2-tre在临床痰液样本上的荧光抗淬灭效果强于AO
图5 Cy3-NO2-tre用于早期评价结核病患者的抗结核治疗效果
研究结论
综上所述，本研究报告了一种对特异性硝基还原酶Rv3368c具有高度响应性的新型荧光探针Cy3-NO2-tre。它可通过结合到细胞壁特异性地强标记MTB，并能快速成像被吞噬的MTB，可作为研究宿主与分枝杆菌相互作用的工具，发现结核病治疗的潜在靶点，促进新型抗结核药物的开发。此外，由于Cy3-NO2-tre具有荧光强度高、本底荧光低、光稳定性好、结构稳定和免洗等特点，它还能以显著的特异度和敏感度检测结核病患者痰液中的活MTB。本研究的初步研究结果表明，Cy3-NO2-tre与AO联用，有可能在早期患者护理阶段追踪抗结核药物治疗方案的疗效，但仍需进行大规模的前瞻性临床调查，进一步研究这种方法与人工智能技术的结合，最终开发出一种快速、准确的疗效评估技术。