文丨初八沒煩惱
編輯丨初八沒煩惱
薄荷是唇形科薄荷屬草本植物，是廣泛種植的藥食同源植物，在藥用方面，薄荷可用于風熱感冒，風溫初起，頭痛，目赤，麻疹，胸脅脹悶等臨床常見症。
在食用方面，薄荷可作為茶飲、香料、鮮食蔬菜等，表明薄荷具有極大的研究和開發價值，茉莉酸是一種重要的天然植物内源激素，廣泛參與植物的生長發育和逆境響應。
JAZ蛋白是JA信号途徑中的關鍵抑制子，作為植物特異性TIFY超級家族的成員之一，JAZs蛋白在N端含有一個保守的TIFY結構域，C端含有一個Jas，也稱為CCT_2的結構域。
同時，TIFY結構域可以介導JAZs蛋白之間的互相作用，形成同源或異源二聚體，并且不同JAZs基因的功能，具有備援性或差異性。
實驗的材料與方法
實驗所用薄荷為M.canadensis，亞細胞定位實驗所用煙草為本氏煙草，所有材料均種植于光照培養箱内，23℃，光照16h/黑暗8h，正常條件下生長3~5周備用。
收集2周大的薄荷幼嫩葉片，置于液氮中，然後使用研缽充分研磨成粉末，根據RNA提取試劑盒的操作說明提取葉片總RNA。
按照反轉錄試劑盒的操作步驟，合成第一鍊cDNA，根據薄荷轉錄組資料鑒定的McJAZ8基因序列。
利用McJAZ8基因全長克隆引物McJAZ8-F:5’-ATGGCTTCCTTTGAGAACGTC-3’；McJAZ8-R:5’-CTACCTGTCTCGTCTCTTCTCC-3’，之後使用PCR擴增候選McJAZ8基因。
PCR擴增體系如下：1µL5×cDNA模闆、2µLPrimeSTAR®DNA聚合酶、5µL5×PrimeSTARDNA聚合酶緩沖液、正向和反向引物各0.5µL、16µL無菌ddH2O，總體積25µL。
擴增程式為：95℃預變性10min；95℃變性15s，指定溫度下退火20s，72℃下延伸45s，34個循環；72℃10min，4℃1min。
随後，使用1%瓊脂糖凝膠進行DNA條帶的鑒定分離，使用DNA純化試劑盒回收McJAZ8基因的PCR産物，置于-20℃儲存備用。
将純化後的PCR産物連接配接至pClone007載體，連接配接産物轉化至大腸杆菌DH5α感受态，挑取單克隆擴大培養，通過菌液PCR進行驗證，确認McJAZ8基因序列的正确性。
實驗結果分析
根據RNA提取試劑盒的步驟，提取薄荷葉片總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢驗，RNA條帶清晰可見，無降解。
并且A260nm/A280nm和A260nm/A230nm的比值在1.9~2.0，核苷酸吸收曲線呈現單峰，表明總RNA品質良好，可用于後續實驗。
将上述RNA反轉錄獲得cDNA，利用RT-PCR實驗擴增McJAZ8全長CDS序列，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在500~750bp有1條清晰可見的PCR條帶。
随後将目的PCR産物建構至pClone007載體，陽性重組子經測序表明該序列為McJAZ8基因。
薄荷McJAZ8基因的編碼序列CDS長度為543bp，将其CDS序列轉換成氨基酸序列，預測McJAZ8蛋白序列的理化性質。
結果顯示，McJAZ8蛋白序列含有180個氨基酸，其分子量為18.96kDa，理論等電點為6.30，該蛋白不穩定系數為55.31，大于40的界限，表明該蛋白為不穩定類蛋白。
分析McJAZ8蛋白二級結構，結果顯示α螺旋占24.44%、β折疊占6.11%、延伸鍊占10.5%和無規則卷曲占58.89%，同時分析McJAZ8的蛋白三級結構。
該蛋白與模闆序列的同一性為83.43%，全據模型品質估計為0.8，與二級結構預測一緻，含有α螺旋、β折疊、延伸鍊和無規則卷曲4種二級結構，其中無規則卷曲為主要結構。
為了鑒定薄荷McJAZ8蛋白，與其他物種JAZs蛋白氨基酸序列之間的相似性，獲得12個拟南芥、15個水稻的、9個黃花蒿的和13個北美雲杉的JAZs蛋白，進行氨基酸序列比對。
所有的JAZs蛋白，都含有高度保守的TIFY和Jas結構域，并且保守結構域内的氨基酸序列高度保守，推測McJAZ8可能參與JA信号。
另外，為了了解McJAZ8，和其他已知物種JAZ蛋白的進化關系，利用MEGA軟體建構了McJAZ8蛋白，和上述不同物種JAZs蛋白的無根系統發育樹。
結果顯示，McJAZ8與拟南芥AtJAZ1、AtJAZ2、黃花蒿AaJAZ4和AaJAZ5蛋白聚為一支，同源關系較近。
為了确定McJAZ8蛋白的亞細胞定位，首先利用WoLFPSORT線上工具預測McJAZ8蛋白的亞細胞定位情況，預測結果顯示，McJAZ8蛋白可能定位于細胞核、細胞質以及線粒體。
建構McJAZ8基因，融合綠色熒光蛋白GFP的重組表達載體McJAZ8-GFP，将GFP空、McJAZ8-GFP、核定位載體SV40-mCherry分别轉化農杆菌GV3101。
将含有不同表達載體的GV3101農杆菌重懸液等體積，混合後注入煙草葉片下表皮進行瞬時共表達。
含有對照GFP空載體，或McJAZ8-GFP融合載體的煙草葉片細胞，在細胞核、細胞質中均觀察到綠色熒光信号，且細胞核中的綠色熒光與紅色熒光重疊。
綜上表明McJAZ8蛋白定位于細胞核、細胞質。
為了探究McJAZ8能否與其自身，或薄荷的其他JAZs蛋白，形成同源或異源二聚體，通過酵母雙雜交實驗将BD-McJAZs和AD-McJAZ8，或BD-McJAZ8和AD-McJAZs的不同質粒組合轉化酵母AH109，并分析它們之間的互作情況。
所有轉化的酵母組合均能在對照培養基DDO上正常生長，然而，隻有AD-McJAZ8分别與BD-McJAZ1、BD-McJAZ3、BD-McJAZ4、BD-McJAZ5、BD-McJAZ8共轉化的酵母。
或者BD-McJAZ8分别與AD-McJAZ1、AD-McJAZ4、AD-McJAZ5、AD-McJAZ8共轉化的酵母，能在選擇培養基QDO上正常生長。
表明McJAZ8能與自身，或McJAZ1、McJAZ3、McJAZ4、McJAZ5互作。
實驗結果讨論
結果表明，茉莉酸信号抑制子JAZ基因在植物中廣泛存在，并且JAZ蛋白通過與下遊轉錄因子結合來抑制茉莉酸信号的傳導，進而調控植物的生長發育、抗病反應和逆境響應等過程。
目前，JAZs基因已在拟南芥、水稻、地錢、小麥、青蒿、丹參等物種中被克隆，然而，在薄荷中有關JAZs基因的研究還處于初級階段。
基于前期的薄荷轉錄組資料，從薄荷中克隆到一條完整的JAZ基因，命名為McJAZ8，基因序列分析發現，McJAZ8基因的編碼序列長度為543bp，這與拟南芥AtJAZs基因的編碼序列長度相似。
此外，McJAZ8蛋白的pI值為6.30，這是由于McJAZ8蛋白氨基酸序列中酸性氨基酸的比例較高的緣故，并且這種現象在其他植物的JAZ蛋白中普遍存在。
氨基酸序列比對分析發現，雖然McJAZ8與其他植物JAZs蛋白間的氨基酸的相似性較低，但McJAZ8與其他植物的JAZ蛋白，都含有一個保守的N端TIFY結構域，和一個C端Jas結構域，表明TIFY和Jas保守結構進化的保守性。
實驗還發現TIFY結構域在調節同源，或異源JAZs蛋白之間的互相作用，以及JAZs蛋白與NINJA蛋白互相作用，募集TPL/TPRs的過程中發揮着雙重功能。
而Jas結構域在JAZs蛋白與茉莉酸受體F-box蛋白Coronatineinsensitive1，和各種轉錄因子的互相作用中起着重要作用，并參與調節JAZ蛋白的亞細胞定位。
亞細胞定位和酵母雙雜交結果顯示，McJAZ8蛋白定位于細胞核，并且能與其他McJAZs蛋白互作形成同源或異源二聚體。
暗示與其他植物中的JAZ蛋白相似，薄荷中的McJAZ8蛋白可能在JA信号應答和調節JA介導的下遊基因表達中具有重要作用，目标基因的組織表達模式與基因功能密切相關。
小麥、橡膠樹和忽地笑中，不同的JAZs基因在不同植物的不同組織中其表達具有一定的組成性和差異性，而且JAZs基因在植物不同組織中的表達，與植物生長發育密切相關。
McJAZ8基因在薄荷的不同組織中均有表達，但在不同組織中其表達水準有所差異，暗示McJAZ8基因，可能在調節薄荷不同組織的生長發育中，發揮重要作用。
拟南芥和水稻的JAZs基因在花和雄蕊的發育中，發揮着重要調節作用，而McJAZ8基因在葉中的表達高于所有其他組織，暗示McJAZ8基因在葉片發育中，可能具有重要的調節功能。
在不同植物中，JA誘導了JAZs基因轉錄豐度的波動，并且，JAZ基因轉錄水準的變化，與JAZ基因在JA介導的植物發育、防禦和特殊代謝産物合成中的調節功能密切相關。
與對照組相比，McJAZ8基因在MeJA處理後的薄荷葉片和根中顯著上調，進一步表明該基因可能參與JA信号傳導。
在不同非生物脅迫處理下，不同植物中JAZs基因的表達表現出一定的差異，如小麥、水稻、茶樹和白菜中，幹旱、鹽和低溫不同程度的誘導JAZs基因的表達，并且這些JAZs基因的上調表達與植物的耐鹽性和耐旱性有關。
本實驗發現McJAZ8基因在幹旱、NaCl脅迫處理的薄荷葉片和根中表現出不同程度的上調表達，推測McJAZ8基因，可能在調節薄荷響應幹旱和鹽脅迫中發揮重要作用。
已有研究顯示JA處理提高了植物對外源镉、銅等金屬離子脅迫的抗性，發現CdCl2、CuCl2和AlCl3處理誘導薄荷葉片和根中McJAZ8基因的表達，表明McJAZ8可能調控薄荷對不同金屬離子脅迫的響應。
此外，JA處理上調了非生物脅迫響應基因McJAZ8的表達，表明薄荷McJAZ8可能通過JA信号通路調節植物對不同脅迫的響應。
從薄荷中克隆獲得McJAZ8基因，該基因編碼序列長度為543bp，編碼180個氨基酸，分子量為18.96kDa，理論等電點為6.30，具有TIFY和Jas保守結構域，與拟南芥AtJAZ1和AtJAZ2的同源性較高。
McJAZ8蛋白定位于細胞核、細胞質，能與自身或McJAZ1、McJAZ3、McJAZ4、McJAZ5互作形成同源或異源二聚體。
其在薄荷的不同組織中廣泛表達，在幼葉中表達量最高，并且McJAZ8基因在葉序中的表達具有波動，在第4片葉中表達量最高，而第2片葉中表達量最低。
而在薄荷葉片和根中對MeJA、幹旱、鹽、CdCl2、CuCl2以及AlCl3處理均有響應，表明McJAZ8可能在調節薄荷中的JA信号轉導，以及調控薄荷應答非生物脅迫中發揮重要作用。