文丨初八沒煩惱
編輯丨初八沒煩惱
植物細胞壁是包圍在植物細胞膜外的一層較厚、較堅韌并略有彈性的結構，通常分為初生細胞壁和次生細胞壁，其中，次生壁主要由纖維素、半纖維素和木質素聚合形成。
次生細胞壁厚而堅硬，為植物生存提供了實體屏障，保護植物免受病原體的侵害，促進對非生物脅迫的耐受性，增強植物細胞長距離運輸水分的能力。
苦荞作為一種重要的藥食同源特色作物，起源于大陸西南地區，屬于蓼科荞麥屬雙子葉植物。
苦荞種子不僅含有豐富的營養物質，還含有豐富的生物活性物質，如黃酮、酚酸、三萜和生物堿等，對人體具有極高的保健作用。
實驗的材料與方法
供試植物材料：厚殼苦荞品種‘品苦荞1号’和薄殼苦荞品種‘貴黑米15号’、質粒pMD19-T、pB‐WA(V)HS-ccdb-GLosgfp質粒、大腸杆菌DH5α、根癌農杆菌GV3101等。
在‘品苦荞1号’和‘貴黑米15号’植株的芽苗期、6葉期和盛花期，取植株的根、莖、葉和花放入做好标記的2mL離心管中，然後迅速放入液氮并轉至-80℃儲存備用。
當實驗基地種植的植株大面積開花後，選取當日綻放的荞麥花朵，用油性馬克筆在選取的花瓣萼片底部做标記，采用相同方法取不同發育時期的籽粒并儲存至-80℃備用。
植物總RNA提取試劑盒，提取‘品苦荞1号’與‘貴黑米15号’植株的根、莖、葉、花，和不同發育期的籽粒的總RNA，實驗設定3個生物學重複。
以提取正常栽培品種厚殼苦荞，‘品苦荞1号’籽粒的總RNA為模闆，使用試劑盒，反轉錄合成用于擴增基因全長CDS序列的第一鍊cDNA。
以‘品苦荞1号’和‘貴黑米15号’的根、莖、葉、花，和不同發育期籽粒的總RNA為模闆，反轉錄用于qPCR。
FtNAC16的引物FtNAC16-qf和FtNAC16-qr，并設計内參基因Actin7的引物FtActin7-f和FtActin7-r。
以‘品苦荞1号’芽苗期和6葉期的根、莖、葉，和花反轉錄得到的第一鍊cDNA為模闆，使用試劑盒進行qPCR分析。
實驗設定3個生物學重複和3個技術重複，以‘品苦荞1号’的花作為對照，用2-ΔΔCt的計算方法。計算目标基因的相對表達量，設定花的2-ΔΔCt的值為1，計算根、莖和葉的表達倍數。
引物設計同1.2.5，以厚殼苦荞‘品苦荞1号’和薄殼苦荞‘貴黑米15号’，不同發育期的籽粒，反轉錄得到的第一鍊cDNA為模闆。
使用試劑盒進行qPCR分析，實驗設定3個生物學重複和3個技術重複，以‘貴黑米15号’籽粒發育4d為對照。
實驗結果分析
以厚殼苦荞‘品苦荞1号’籽粒的cDNA為模闆，擴增FtNAC16的全長CDS序列，獲得1條符合預期大小的目的條帶。
對測序結果進行比對，發現擴增的目的條帶序列與苦荞基因組參照序列完全一緻，FtNAC16的CDS序列全長為1086bp，共編碼361個氨基酸。
使用BioXM2.6軟體對FtNAC16分析，結果顯示該基因編碼蛋白的分子量為90.54kD，理論等電點為4.849。
資料分析顯示，Ft‐NAC16蛋白二級結構包含19.39%α-螺旋、61.77%不規則卷曲、14.40%β-折疊以及4.43%β-轉角。
對FtNAC16的三級結構進行預測，結果顯示，FtNAC16與脅迫誘導轉錄因子NAC1的相似性能夠達到100%，與二級結構預測結果一緻。
将FtNAC16與NAC家族蛋白序列進行多序列比對，發現FtNAC16及其同源蛋白序列N端均具有約150個氨基酸的高保守NAM結構域，表明FtNAC16是NAC家族成員。
将Ft‐NAC16與其他植物中，調控次生壁生物合成的NAC轉錄因子，建構系統進化樹。
結果表明，FtNAC16與玉米ZmSWN1和ZmSWN2、拟南芥AtNST2、楊樹PtrWND2A、水稻OsSWN1和OsSWN2聚為一支，且與AtNST2和PtrWND2A關系最近。
采用凍融法，将無縫克隆建構的pBWA(V)HS-FtNAC16-GLosgfp融合蛋白載體，和pBWA(V)HS-GLosgfp轉入根癌農杆菌GV3101感受态胞中。
将獲得的陽性轉化子擴大培養、重懸，通過注射法浸染本氏煙草葉片，在共聚焦顯微鏡下觀察GFP的表達情況。
對照組空載體的熒光信号分布在煙草表皮細胞的細胞膜、細胞質和細胞核上，而pBWA融合蛋白的熒光信号隻分布在細胞核中，由此可得，FtNAC16定位于細胞核。
利用qPCR檢測FtNAC16在厚殼苦荞'品苦1号'不同組織部位的表達情況，結果表明，其在芽苗期和6葉期具有相同的表達模式，即其在兩個發育時期的各組織部位中的表達量，從高至低均依次為莖、根、葉，此外，FtNAC16在生殖器苦荞的花中表達量也較高。
以厚殼苦荞‘品苦荞1号’和薄殼苦荞‘貴黑米15号’為樣本，利用qPCR檢測FtNAC16在厚殼苦荞和薄殼苦荞，不同發育時期籽粒中的表達量差異。
結果顯示，在厚殼苦荞中，FtNAC16表達呈上升趨勢，且在籽粒發育7d時達到最高，與薄殼苦荞相比差異極顯著。
随後表達下降，在籽粒發育4、10和13d時，FtNAC16在厚殼苦荞和薄殼苦荞中，表達差異不顯著。
檢測1個與次生壁生物合成相關的，下遊調控基因和2個結構基因，在厚殼苦荞和薄殼苦荞的，不同發育時期的籽粒中的表達。
結果顯示，FtMYB103、FtCESA4和FtCESA8，在籽粒發育7d時表達最高，且與FtNAC16的表達顯著正相關。
此外，FtMYB103和FtCESA8在籽粒發育第13天表達再次增加，趨勢與FtNAC16一緻，由此可推測FtNAC16，具有調控下遊次生壁生物合成相關調控基因，和結構基因的功能。
實驗結果讨論
苦荞果殼厚且堅韌，導緻其脫殼非常困難，已經成為制約苦荞加工産業發展的世界性難題。挖掘苦荞果殼中，次生細胞壁生物合成調控基因，并解析其分子調控機制。
可為今後通過基因編輯等基因操作，和分子标記輔助育種，培育高産、優質、适應性強的易脫殼苦荞新品種，提供優異的基因資源。
研究表明，NAC轉錄因子，在植物細胞次生壁生物合成中，具有及其重要的調控作用。
NAC是植物特有的轉錄因子之一，其蛋白序列N端含有一個約150個氨基酸殘基組成的高度保守的DNA結合結構域。
通過RTPCR技術從正常苦荞‘品苦荞1号’中，克隆得到1個NAC轉錄因子基因FtNAC16，編碼蛋白序列由361個氨基酸殘基組成。
其蛋白序列N端，含有一個屬于NAC轉錄因子家族的保守結構域，FtNAC16蛋白定位于細胞核。
模式植物拟南芥和其他植物中的研究表明，NAC轉錄因子作為細胞次生壁生物合成的一級開關，在細胞次生壁合成中具有決定性調控作用。
通過系統進化樹分析顯示，FtNAC16與其他植物中，參與細胞次生壁合成調控的NAC家族成員聚為一支，且與拟南芥AtNST2、楊樹PtrWND2A親緣關系最近。
不同組織部位表達分析顯示，這些結果顯示，FtNAC16是植FtNAC16主要在發育後期，纖維化程度高的組織部位莖、根和花中高表達。
物次生壁合成，調控NAC轉錄因子NST2的同源基因，其在苦荞中可能具有與他的同源基因類似的，調控細胞次生壁合成的功能。
厚殼苦荞果殼細胞次生壁明顯厚于薄殼苦荞，導緻其果殼厚而堅韌，脫殼極其困難，在拟南芥中的研究表明，次生壁合成調控NAC轉錄因子AtNST1、AtNST2、AtNST3。
通過直接或間接調控，次生壁合成下遊調控基因MYB轉錄因子，和次生壁組成纖維素、半纖維素合成的結構基因表達，進而促進細胞次生壁加厚。
實驗發現FtNAC16，在厚殼苦荞和薄殼苦荞早期發育果殼中高表達，但其在厚殼苦荞籽粒中的表達量遠高于薄殼苦荞。
此外，拟南芥的AtNST2調控的下遊調控基因AtMYB103，和纖維素合成結構基因AtCESA4和AtCESA8的表達。
其在苦荞中的同源基因FtMYB103、FtCESA4和FtCESA8在厚殼苦荞和薄殼苦荞，不同發育時期籽粒中的表達模式與FtNAC16高度相似。
這些結果表明，FtNAC16可能通過調控次生壁合成下，遊調控基因和結構基因的表達，來調控苦荞果殼次生壁加厚。
但是，基因FtNAC16在苦荞次生壁生物合成中的功能，及其詳細的分子調控機制，仍需進一步深入研究。
從‘品苦荞1号’中克隆了NAC轉錄因子基因FtNAC16，并進行了生物資訊學、亞細胞定位與基因表達分析。
發現FtNAC16屬于NAC家族成員，是核定位轉錄因子，與拟南芥中調控次生壁加厚的AtNST2親緣關系最近。
FtNAC16主要在根、莖、花和早期發育的籽粒中高表達，在籽粒發育早期的厚殼苦荞中的FtNAC16表達量顯著高于薄殼苦荞。
FtNAC16與次生壁形成的下遊調控基因FtMYB103，與纖維素合成的結構基因FtCESA4和FtCESA8，在厚殼苦荞和薄殼苦荞不同發育時期，籽粒中的表達高度正相關。
表明FtNAC16，可能在苦荞次生壁生物合成中具有重要調控作用。