文丨初八没烦恼
编辑丨初八没烦恼
植物细胞壁是包围在植物细胞膜外的一层较厚、较坚韧并略有弹性的结构，通常分为初生细胞壁和次生细胞壁，其中，次生壁主要由纤维素、半纤维素和木质素聚合形成。
次生细胞壁厚而坚硬，为植物生存提供了物理屏障，保护植物免受病原体的侵害，促进对非生物胁迫的耐受性，增强植物细胞长距离运输水分的能力。
苦荞作为一种重要的药食同源特色作物，起源于大陆西南地区，属于蓼科荞麦属双子叶植物。
苦荞种子不仅含有丰富的营养物质，还含有丰富的生物活性物质，如黄酮、酚酸、三萜和生物碱等，对人体具有极高的保健作用。
实验的材料与方法
供试植物材料：厚壳苦荞品种‘品苦荞1号’和薄壳苦荞品种‘贵黑米15号’、质粒pMD19-T、pB‐WA(V)HS-ccdb-GLosgfp质粒、大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌GV3101等。
在‘品苦荞1号’和‘贵黑米15号’植株的芽苗期、6叶期和盛花期，取植株的根、茎、叶和花放入做好标记的2mL离心管中，然后迅速放入液氮并转至-80℃保存备用。
当实验基地种植的植株大面积开花后，选取当日绽放的荞麦花朵，用油性马克笔在选取的花瓣萼片底部做标记，采用相同方法取不同发育时期的籽粒并保存至-80℃备用。
植物总RNA提取试剂盒，提取‘品苦荞1号’与‘贵黑米15号’植株的根、茎、叶、花，和不同发育期的籽粒的总RNA，实验设置3个生物学重复。
以提取常规栽培品种厚壳苦荞，‘品苦荞1号’籽粒的总RNA为模板，使用试剂盒，反转录合成用于扩增基因全长CDS序列的第一链cDNA。
以‘品苦荞1号’和‘贵黑米15号’的根、茎、叶、花，和不同发育期籽粒的总RNA为模板，反转录用于qPCR。
FtNAC16的引物FtNAC16-qf和FtNAC16-qr，并设计内参基因Actin7的引物FtActin7-f和FtActin7-r。
以‘品苦荞1号’芽苗期和6叶期的根、茎、叶，和花反转录得到的第一链cDNA为模板，使用试剂盒进行qPCR分析。
实验设置3个生物学重复和3个技术重复，以‘品苦荞1号’的花作为对照，用2-ΔΔCt的计算方法。计算目标基因的相对表达量，设置花的2-ΔΔCt的值为1，计算根、茎和叶的表达倍数。
引物设计同1.2.5，以厚壳苦荞‘品苦荞1号’和薄壳苦荞‘贵黑米15号’，不同发育期的籽粒，反转录得到的第一链cDNA为模板。
使用试剂盒进行qPCR分析，实验设置3个生物学重复和3个技术重复，以‘贵黑米15号’籽粒发育4d为对照。
实验结果分析
以厚壳苦荞‘品苦荞1号’籽粒的cDNA为模板，扩增FtNAC16的全长CDS序列，获得1条符合预期大小的目的条带。
对测序结果进行比对，发现扩增的目的条带序列与苦荞基因组参照序列完全一致，FtNAC16的CDS序列全长为1086bp，共编码361个氨基酸。
使用BioXM2.6软件对FtNAC16分析，结果显示该基因编码蛋白的分子量为90.54kD，理论等电点为4.849。
数据分析显示，Ft‐NAC16蛋白二级结构包含19.39%α-螺旋、61.77%不规则卷曲、14.40%β-折叠以及4.43%β-转角。
对FtNAC16的三级结构进行预测，结果显示，FtNAC16与胁迫诱导转录因子NAC1的相似性能够达到100%，与二级结构预测结果一致。
将FtNAC16与NAC家族蛋白序列进行多序列比对，发现FtNAC16及其同源蛋白序列N端均具有约150个氨基酸的高保守NAM结构域，表明FtNAC16是NAC家族成员。
将Ft‐NAC16与其他植物中，调控次生壁生物合成的NAC转录因子，构建系统进化树。
结果表明，FtNAC16与玉米ZmSWN1和ZmSWN2、拟南芥AtNST2、杨树PtrWND2A、水稻OsSWN1和OsSWN2聚为一支，且与AtNST2和PtrWND2A关系最近。
采用冻融法，将无缝克隆构建的pBWA(V)HS-FtNAC16-GLosgfp融合蛋白载体，和pBWA(V)HS-GLosgfp转入根癌农杆菌GV3101感受态胞中。
将获得的阳性转化子扩大培养、重悬，通过注射法浸染本氏烟草叶片，在共聚焦显微镜下观察GFP的表达情况。
对照组空载体的荧光信号分布在烟草表皮细胞的细胞膜、细胞质和细胞核上，而pBWA融合蛋白的荧光信号只分布在细胞核中，由此可得，FtNAC16定位于细胞核。
利用qPCR检测FtNAC16在厚壳苦荞'品苦1号'不同组织部位的表达情况，结果表明，其在芽苗期和6叶期具有相同的表达模式，即其在两个发育时期的各组织部位中的表达量，从高至低均依次为茎、根、叶，此外，FtNAC16在生殖器苦荞的花中表达量也较高。
以厚壳苦荞‘品苦荞1号’和薄壳苦荞‘贵黑米15号’为样本，利用qPCR检测FtNAC16在厚壳苦荞和薄壳苦荞，不同发育时期籽粒中的表达量差异。
结果显示，在厚壳苦荞中，FtNAC16表达呈上升趋势，且在籽粒发育7d时达到最高，与薄壳苦荞相比差异极显著。
随后表达下降，在籽粒发育4、10和13d时，FtNAC16在厚壳苦荞和薄壳苦荞中，表达差异不显著。
检测1个与次生壁生物合成相关的，下游调控基因和2个结构基因，在厚壳苦荞和薄壳苦荞的，不同发育时期的籽粒中的表达。
结果显示，FtMYB103、FtCESA4和FtCESA8，在籽粒发育7d时表达最高，且与FtNAC16的表达显著正相关。
此外，FtMYB103和FtCESA8在籽粒发育第13天表达再次增加，趋势与FtNAC16一致，由此可推测FtNAC16，具有调控下游次生壁生物合成相关调控基因，和结构基因的功能。
实验结果讨论
苦荞果壳厚且坚韧，导致其脱壳非常困难，已经成为制约苦荞加工产业发展的世界性难题。挖掘苦荞果壳中，次生细胞壁生物合成调控基因，并解析其分子调控机制。
可为今后通过基因编辑等基因操作，和分子标记辅助育种，培育高产、优质、适应性强的易脱壳苦荞新品种，提供优异的基因资源。
研究表明，NAC转录因子，在植物细胞次生壁生物合成中，具有及其重要的调控作用。
NAC是植物特有的转录因子之一，其蛋白序列N端含有一个约150个氨基酸残基组成的高度保守的DNA结合结构域。
通过RTPCR技术从常规苦荞‘品苦荞1号’中，克隆得到1个NAC转录因子基因FtNAC16，编码蛋白序列由361个氨基酸残基组成。
其蛋白序列N端，含有一个属于NAC转录因子家族的保守结构域，FtNAC16蛋白定位于细胞核。
模式植物拟南芥和其他植物中的研究表明，NAC转录因子作为细胞次生壁生物合成的一级开关，在细胞次生壁合成中具有决定性调控作用。
通过系统进化树分析显示，FtNAC16与其他植物中，参与细胞次生壁合成调控的NAC家族成员聚为一支，且与拟南芥AtNST2、杨树PtrWND2A亲缘关系最近。
不同组织部位表达分析显示，这些结果显示，FtNAC16是植FtNAC16主要在发育后期，纤维化程度高的组织部位茎、根和花中高表达。
物次生壁合成，调控NAC转录因子NST2的同源基因，其在苦荞中可能具有与他的同源基因类似的，调控细胞次生壁合成的功能。
厚壳苦荞果壳细胞次生壁明显厚于薄壳苦荞，导致其果壳厚而坚韧，脱壳极其困难，在拟南芥中的研究表明，次生壁合成调控NAC转录因子AtNST1、AtNST2、AtNST3。
通过直接或间接调控，次生壁合成下游调控基因MYB转录因子，和次生壁组成纤维素、半纤维素合成的结构基因表达，进而促进细胞次生壁加厚。
实验发现FtNAC16，在厚壳苦荞和薄壳苦荞早期发育果壳中高表达，但其在厚壳苦荞籽粒中的表达量远高于薄壳苦荞。
此外，拟南芥的AtNST2调控的下游调控基因AtMYB103，和纤维素合成结构基因AtCESA4和AtCESA8的表达。
其在苦荞中的同源基因FtMYB103、FtCESA4和FtCESA8在厚壳苦荞和薄壳苦荞，不同发育时期籽粒中的表达模式与FtNAC16高度相似。
这些结果表明，FtNAC16可能通过调控次生壁合成下，游调控基因和结构基因的表达，来调控苦荞果壳次生壁加厚。
但是，基因FtNAC16在苦荞次生壁生物合成中的功能，及其详细的分子调控机制，仍需进一步深入研究。
从‘品苦荞1号’中克隆了NAC转录因子基因FtNAC16，并进行了生物信息学、亚细胞定位与基因表达分析。
发现FtNAC16属于NAC家族成员，是核定位转录因子，与拟南芥中调控次生壁加厚的AtNST2亲缘关系最近。
FtNAC16主要在根、茎、花和早期发育的籽粒中高表达，在籽粒发育早期的厚壳苦荞中的FtNAC16表达量显著高于薄壳苦荞。
FtNAC16与次生壁形成的下游调控基因FtMYB103，与纤维素合成的结构基因FtCESA4和FtCESA8，在厚壳苦荞和薄壳苦荞不同发育时期，籽粒中的表达高度正相关。
表明FtNAC16，可能在苦荞次生壁生物合成中具有重要调控作用。