文丨初八没烦恼
编辑丨初八没烦恼
薄荷是唇形科薄荷属草本植物，是广泛种植的药食同源植物，在药用方面，薄荷可用于风热感冒，风温初起，头痛，目赤，麻疹，胸胁胀闷等临床常见症。
在食用方面，薄荷可作为茶饮、香料、鲜食蔬菜等，表明薄荷具有极大的研究和开发价值，茉莉酸是一种重要的天然植物内源激素，广泛参与植物的生长发育和逆境响应。
JAZ蛋白是JA信号途径中的关键抑制子，作为植物特异性TIFY超级家族的成员之一，JAZs蛋白在N端含有一个保守的TIFY结构域，C端含有一个Jas，也称为CCT_2的结构域。
同时，TIFY结构域可以介导JAZs蛋白之间的相互作用，形成同源或异源二聚体，并且不同JAZs基因的功能，具有冗余性或差异性。
实验的材料与方法
实验所用薄荷为M.canadensis，亚细胞定位实验所用烟草为本氏烟草，所有材料均种植于光照培养箱内，23℃，光照16h/黑暗8h，正常条件下生长3~5周备用。
收集2周大的薄荷幼嫩叶片，置于液氮中，然后使用研钵充分研磨成粉末，根据RNA提取试剂盒的操作说明提取叶片总RNA。
按照反转录试剂盒的操作步骤，合成第一链cDNA，根据薄荷转录组数据鉴定的McJAZ8基因序列。
利用McJAZ8基因全长克隆引物McJAZ8-F:5’-ATGGCTTCCTTTGAGAACGTC-3’；McJAZ8-R:5’-CTACCTGTCTCGTCTCTTCTCC-3’，之后使用PCR扩增候选McJAZ8基因。
PCR扩增体系如下：1µL5×cDNA模板、2µLPrimeSTAR®DNA聚合酶、5µL5×PrimeSTARDNA聚合酶缓冲液、正向和反向引物各0.5µL、16µL无菌ddH2O，总体积25µL。
扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，指定温度下退火20s，72℃下延伸45s，34个循环；72℃10min，4℃1min。
随后，使用1%琼脂糖凝胶进行DNA条带的鉴定分离，使用DNA纯化试剂盒回收McJAZ8基因的PCR产物，置于-20℃保存备用。
将纯化后的PCR产物连接至pClone007载体，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态，挑取单克隆扩大培养，通过菌液PCR进行验证，确认McJAZ8基因序列的正确性。
实验结果分析
根据RNA提取试剂盒的步骤，提取薄荷叶片总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检验，RNA条带清晰可见，无降解。
并且A260nm/A280nm和A260nm/A230nm的比值在1.9~2.0，核苷酸吸收曲线呈现单峰，表明总RNA质量良好，可用于后续实验。
将上述RNA反转录获得cDNA，利用RT-PCR实验扩增McJAZ8全长CDS序列，琼脂糖凝胶电泳结果显示，在500~750bp有1条清晰可见的PCR条带。
随后将目的PCR产物构建至pClone007载体，阳性重组子经测序表明该序列为McJAZ8基因。
薄荷McJAZ8基因的编码序列CDS长度为543bp，将其CDS序列转换成氨基酸序列，预测McJAZ8蛋白序列的理化性质。
结果显示，McJAZ8蛋白序列含有180个氨基酸，其分子量为18.96kDa，理论等电点为6.30，该蛋白不稳定系数为55.31，大于40的界限，表明该蛋白为不稳定类蛋白。
分析McJAZ8蛋白二级结构，结果显示α螺旋占24.44%、β折叠占6.11%、延伸链占10.5%和无规则卷曲占58.89%，同时分析McJAZ8的蛋白三级结构。
该蛋白与模板序列的同一性为83.43%，全据模型质量估计为0.8，与二级结构预测一致，含有α螺旋、β折叠、延伸链和无规则卷曲4种二级结构，其中无规则卷曲为主要结构。
为了鉴定薄荷McJAZ8蛋白，与其他物种JAZs蛋白氨基酸序列之间的相似性，获得12个拟南芥、15个水稻的、9个黄花蒿的和13个北美云杉的JAZs蛋白，进行氨基酸序列比对。
所有的JAZs蛋白，都含有高度保守的TIFY和Jas结构域，并且保守结构域内的氨基酸序列高度保守，推测McJAZ8可能参与JA信号。
另外，为了了解McJAZ8，和其他已知物种JAZ蛋白的进化关系，利用MEGA软件构建了McJAZ8蛋白，和上述不同物种JAZs蛋白的无根系统发育树。
结果显示，McJAZ8与拟南芥AtJAZ1、AtJAZ2、黄花蒿AaJAZ4和AaJAZ5蛋白聚为一支，同源关系较近。
为了确定McJAZ8蛋白的亚细胞定位，首先利用WoLFPSORT在线工具预测McJAZ8蛋白的亚细胞定位情况，预测结果显示，McJAZ8蛋白可能定位于细胞核、细胞质以及线粒体。
构建McJAZ8基因，融合绿色荧光蛋白GFP的重组表达载体McJAZ8-GFP，将GFP空、McJAZ8-GFP、核定位载体SV40-mCherry分别转化农杆菌GV3101。
将含有不同表达载体的GV3101农杆菌重悬液等体积，混合后注入烟草叶片下表皮进行瞬时共表达。
含有对照GFP空载体，或McJAZ8-GFP融合载体的烟草叶片细胞，在细胞核、细胞质中均观察到绿色荧光信号，且细胞核中的绿色荧光与红色荧光重叠。
综上表明McJAZ8蛋白定位于细胞核、细胞质。
为了探究McJAZ8能否与其自身，或薄荷的其他JAZs蛋白，形成同源或异源二聚体，通过酵母双杂交实验将BD-McJAZs和AD-McJAZ8，或BD-McJAZ8和AD-McJAZs的不同质粒组合转化酵母AH109，并分析它们之间的互作情况。
所有转化的酵母组合均能在对照培养基DDO上正常生长，然而，只有AD-McJAZ8分别与BD-McJAZ1、BD-McJAZ3、BD-McJAZ4、BD-McJAZ5、BD-McJAZ8共转化的酵母。
或者BD-McJAZ8分别与AD-McJAZ1、AD-McJAZ4、AD-McJAZ5、AD-McJAZ8共转化的酵母，能在选择培养基QDO上正常生长。
表明McJAZ8能与自身，或McJAZ1、McJAZ3、McJAZ4、McJAZ5互作。
实验结果讨论
结果表明，茉莉酸信号抑制子JAZ基因在植物中广泛存在，并且JAZ蛋白通过与下游转录因子结合来抑制茉莉酸信号的传导，进而调控植物的生长发育、抗病反应和逆境响应等过程。
目前，JAZs基因已在拟南芥、水稻、地钱、小麦、青蒿、丹参等物种中被克隆，然而，在薄荷中有关JAZs基因的研究还处于初级阶段。
基于前期的薄荷转录组数据，从薄荷中克隆到一条完整的JAZ基因，命名为McJAZ8，基因序列分析发现，McJAZ8基因的编码序列长度为543bp，这与拟南芥AtJAZs基因的编码序列长度相似。
此外，McJAZ8蛋白的pI值为6.30，这是由于McJAZ8蛋白氨基酸序列中酸性氨基酸的比例较高的缘故，并且这种现象在其他植物的JAZ蛋白中普遍存在。
氨基酸序列比对分析发现，虽然McJAZ8与其他植物JAZs蛋白间的氨基酸的相似性较低，但McJAZ8与其他植物的JAZ蛋白，都含有一个保守的N端TIFY结构域，和一个C端Jas结构域，表明TIFY和Jas保守结构进化的保守性。
实验还发现TIFY结构域在调节同源，或异源JAZs蛋白之间的相互作用，以及JAZs蛋白与NINJA蛋白相互作用，募集TPL/TPRs的过程中发挥着双重功能。
而Jas结构域在JAZs蛋白与茉莉酸受体F-box蛋白Coronatineinsensitive1，和各种转录因子的相互作用中起着重要作用，并参与调节JAZ蛋白的亚细胞定位。
亚细胞定位和酵母双杂交结果显示，McJAZ8蛋白定位于细胞核，并且能与其他McJAZs蛋白互作形成同源或异源二聚体。
暗示与其他植物中的JAZ蛋白相似，薄荷中的McJAZ8蛋白可能在JA信号应答和调节JA介导的下游基因表达中具有重要作用，目标基因的组织表达模式与基因功能密切相关。
小麦、橡胶树和忽地笑中，不同的JAZs基因在不同植物的不同组织中其表达具有一定的组成性和差异性，而且JAZs基因在植物不同组织中的表达，与植物生长发育密切相关。
McJAZ8基因在薄荷的不同组织中均有表达，但在不同组织中其表达水平有所差异，暗示McJAZ8基因，可能在调节薄荷不同组织的生长发育中，发挥重要作用。
拟南芥和水稻的JAZs基因在花和雄蕊的发育中，发挥着重要调节作用，而McJAZ8基因在叶中的表达高于所有其他组织，暗示McJAZ8基因在叶片发育中，可能具有重要的调节功能。
在不同植物中，JA诱导了JAZs基因转录丰度的波动，并且，JAZ基因转录水平的变化，与JAZ基因在JA介导的植物发育、防御和特殊代谢产物合成中的调节功能密切相关。
与对照组相比，McJAZ8基因在MeJA处理后的薄荷叶片和根中显著上调，进一步表明该基因可能参与JA信号传导。
在不同非生物胁迫处理下，不同植物中JAZs基因的表达表现出一定的差异，如小麦、水稻、茶树和白菜中，干旱、盐和低温不同程度的诱导JAZs基因的表达，并且这些JAZs基因的上调表达与植物的耐盐性和耐旱性有关。
本实验发现McJAZ8基因在干旱、NaCl胁迫处理的薄荷叶片和根中表现出不同程度的上调表达，推测McJAZ8基因，可能在调节薄荷响应干旱和盐胁迫中发挥重要作用。
已有研究显示JA处理提高了植物对外源镉、铜等金属离子胁迫的抗性，发现CdCl2、CuCl2和AlCl3处理诱导薄荷叶片和根中McJAZ8基因的表达，表明McJAZ8可能调控薄荷对不同金属离子胁迫的响应。
此外，JA处理上调了非生物胁迫响应基因McJAZ8的表达，表明薄荷McJAZ8可能通过JA信号通路调节植物对不同胁迫的响应。
从薄荷中克隆获得McJAZ8基因，该基因编码序列长度为543bp，编码180个氨基酸，分子量为18.96kDa，理论等电点为6.30，具有TIFY和Jas保守结构域，与拟南芥AtJAZ1和AtJAZ2的同源性较高。
McJAZ8蛋白定位于细胞核、细胞质，能与自身或McJAZ1、McJAZ3、McJAZ4、McJAZ5互作形成同源或异源二聚体。
其在薄荷的不同组织中广泛表达，在幼叶中表达量最高，并且McJAZ8基因在叶序中的表达具有波动，在第4片叶中表达量最高，而第2片叶中表达量最低。
而在薄荷叶片和根中对MeJA、干旱、盐、CdCl2、CuCl2以及AlCl3处理均有响应，表明McJAZ8可能在调节薄荷中的JA信号转导，以及调控薄荷应答非生物胁迫中发挥重要作用。