文丨初八沒煩惱
編輯丨初八沒煩惱
萱草為阿福花科萱草屬植物，是中國一種用途很廣、兼具觀賞和食用價值的傳統花卉。
植物葉片，是植物進行光合作用的主要器官，其生長發育，主要由基因程式設計及環境兩方面的調控共同決定。
細胞色素P450或稱為CYPs，在450nm處有最大吸光度，是最大和最多樣化的酶超家族之一。CYP90B1，又稱DWF4。GhCYP90B1是一種棉花類固醇C22α-羟化酶基因。
CYPs廣泛存在于生物體内，其主要功能為，代謝解毒及參與合成植物次級代謝産物等。
底物和功能的多樣性是CYPs的特征，并被認為是不同生物體中，由不同的代謝或環境需求驅動，而進化适應的結果。
實驗的材料與方法
主要試劑：RNA提取試劑盒，逆轉錄試劑盒，瓊脂糖凝膠回收試劑盒，PCR試劑盒、大腸杆菌為TOP10感受态細胞、克隆載體為pMDTM18-T、BM2000DNAMarker。
将采集的萱草葉片樣品放入液氮中進行研磨，提取總RNA，檢測RNA的純度及濃度。
cDNA第一鍊合成：RNA2μL、AccuRTReactionMix(4X)2μL、ddH2O4μL，42℃2min，再依次加入AccuRTReactionStopper(5x)2μL、5×All-In-OneRTMasterMix4μL、ddH2O6μL。
反應總體積20μL，25℃10min；42℃50min；85℃5min。逆轉錄後得到的cDNA儲存于-20℃冰箱備用。
根據萱草轉錄組組裝注釋結果，設計HfCYP90B1基因PCR引物如下：F：ATGCTATCTGAACAGTTTAG；R：TCAGAGTTCAGCTGATATTG。
以上述cDNA為模闆擴增候選基因的目的片段，擴增程式為：98℃3min；98℃10s，56℃30s，72℃90s，35個循環；72℃5min；儲存于4℃。
擴增體系50μL：cDNA模闆2μL，PremixTaq25μL，上、下遊引物各1μL，餘下用ddH2O補齊。利用DNA凝膠回收試劑盒，選取上述産物條帶的長度與亮度均合适，則可進行膠回收。
回收後的産物與克隆載體pMDTM18-T連接配接，轉化至大腸杆菌TOP10感受态細胞内，塗布于帶有氨苄的LB固體培養基上，于37℃恒溫培養箱中培養12h。
将核苷酸序列在ExPASy線上網站翻譯成蛋白質序列；利用ProtParam線上軟體預測蛋白序列的基本理化性質。
該蛋白質的親/疏水性、亞細胞定位、信号肽與跨膜結構，主要通過protscale、WOLFPSORT、SignalP4.1和TMHMMServerv.2.0網站，進行預測分析。
利用NetPhos3.1線上網站對磷酸化位點進行預測；而HfCYP90B1蛋白的二級結構與三級結構預測，則分别通過SOPMA和SWISS-MODEL進行。
使用MEGA-X軟體采用NJ法即鄰接法，bootstrap值重複1000次，建構系統發育進化樹。
利用實時熒光定量PCR儀對HfCYP90B1進行表達分析，3次生物學重複，3次技術重複，内參基因選擇植物常用的ACT。
PCR反應體系：ChamQSYBRColorqPCRMasterMix16.5μL，cDNA模闆2μL，ForwardPrimer0.8μL，ReversePrimer0.8μL，ddH2O14μL。
擴增程式：95℃5min，95℃5s，50℃30s，72℃40s，40個循環；儲存于4℃。表達量的計算采用2-△△CT，對葉面積大和葉面積小的，HfCYP90B1基因表達量進行檢測分析。
實驗結果分析
植物CYPs可參與催化許多初級、次級代謝反應，在植物中起着重要的生物合成作用，它的反應底物，是類固醇等内源性化合物及外源物質等。
CYPs廣泛存在于生物體内，其主要功能，為代謝解毒及參與合成植物次級代謝産物等。
底物和功能的多樣性是CYPs的特征，并被認為是不同生物體中，由不同的代謝或環境需求驅動，而進化适應的結果。
以合成第一鍊cDNA為模闆進行PCR擴增，對其産物進行檢測，電泳結果表明，在750~1000bp有1條特異性條帶，獲得與預期産物長度相符的特異性條帶，符合目标基因要求。
将該擴增産物膠回收、連接配接克隆載體，連接配接産物轉化至感受态細胞大腸杆菌TOP10中，将連接配接後大腸杆菌進行平闆塗布，并挑取單菌落并進行菌落PCR鑒定，将條帶正确的送至生工進行測序驗證。
經測序結果顯示其産物長度為838bp，且與轉錄組組裝序列完全一緻，将該基因命名為HfCYP90B1。
對HfCYP90B1編碼蛋白的理化性質利用蛋白組學分析平台ExPASy進行分析，結果為HfCYP90B1基因中含有氨基酸143個，分子式為C738H1162N200O198S8。
分子品質為16.26105kD，原子總數為2306，脂肪族指數為43.10，殘基負電荷數Asp+Glu13個，殘基正電荷數Arg+Lys17個，理論電點pI為9.12，則其為堿性蛋白。
該蛋白不穩定性指數II為43.10，則其為不穩定蛋白。親水性平均系數為-0.026，則其為親水性蛋白。基于此推測該蛋白為親水性不穩定堿性蛋白。
通過Conserveddomains資料庫對HfCYP90B1蛋白保守結構域進行分析，該蛋白存在1個特異位點Cypx，3個非特異位點CYP90-like、PLN02500、p450，屬于p450、cytochrome-p450和Cypx超家族。
利用TMHMMServerv.2.0預測跨膜結構域結果顯示：該蛋白整個序列都在膜外，無跨膜結構域，故不屬于跨膜蛋白。
通過SignalP4.1Server線上網站以預測信号肽，結果表明：該蛋白不含有信号肽位點，故屬于非分泌蛋白。
從WOLFPSORT線上網站預測亞細胞定位，結果表明：位于細胞質的系數為8，定位于葉綠體的系數為2，定位于細胞核、線粒體、過氧物酶體的系數為1。
通過NetPhos3.1Server線上網站預測磷酸化位點，發現HfCYP90B1共有15個蛋白磷酸化位點值>0.5，分别為10個絲氨酸位點和3個蘇氨酸位點和2個酪氨酸位點。
對萱草HfCYP90B1氨基酸序列，共編碼135個氨基酸，其中無規則卷曲含量最多為47.55%，而α-螺旋、延伸鍊和β-折疊含量，分别為30.07%、16.78%和5.59%。
通過同源模組化方法預測HfCYP90B1蛋白的三維結構，HfCYP90B1以6a18.1.A蛋白為模闆，用于建立該模型的氨基酸殘基範圍為1~139位，序列一緻性為51.82%，序列相似度為46%。
利用HfCYP90B1基因序列建構的系統進化樹，發現HfCYP90B1與其他植物物種基因具有同源性，HfCYP90B1與鳳梨聚為同一支，同源性為74%。
将HfCYP90B1基因，在萱草K品種不同葉面積株系中的相對表達量進行比較，結果表明，HfCYP90B1基因，在K品種3株不同葉面積的萱草中相對表達量不同。
其在K1株系中相對表達量最高；在K3株系中相對表達量最低，約為K1株系的0.179倍，而在K2株系中的表達量約為K1株系的0.33倍。
HfCYP90B1基因在萱草中，相對表達量與葉面積變化趨勢完全一緻，即K1>K3>K2。
HfCYP90B1基因表達量在寬葉中，整體呈現出上調表達趨勢。由此可以推測，HfCYP90B1基因極可能參與調控了萱草葉片生長。
實驗結果讨論
研究表明，CYP450s可與多種底物發生互相作用，參與植物生長發育過程中的，多種次級代謝反應，對植物的生命網絡系統具有重要的調控功能。
BRs對植物的開花時間、種子産量及抗逆性等重要的農藝性狀均有調控作用；對植物的生長和發育也是必不可少的，并積極參與許多生理過程，增強了植物在逆境下的抗逆性。
在不受生長素、赤黴素和乙烯的作用下，能夠促進葉柄伸長和葉片向上彎曲的過度增加。
除赤黴素、細胞分裂素、生長素、乙烯、脫落酸之外，油菜素甾醇被認為是第六大類植物内源性激素。
CYP90B1是C-22位羟化酶，是以也是BRs生物合成途徑的關鍵限速酶，其催化反應是合成BRs的關鍵步驟，在BRs的生物合成途徑中有重要調控作用。
過量表達CYP90B1可有效調節BRs的生物合成。DWF4基因能夠提高玉米和拟南芥的産量。高溫脅迫下，拟南芥CYP90B1基因表達上調，BRs含量升高。
在歐洲油菜中，表達了拟南芥BRs生物合成基因AtDWF4，發現BRs可以提高，非生物和生物脅迫的耐受性和植物的生産力。
以上研究結果均可證明CYP90B1基因能夠通過調節内源BRs的生物合成量，進而促進植物生長、增加作物産量、提高植物的抗逆能力。
研究表明，CYP90B1參與調控玉米、拟南芥等植物的生長發育活動，并在拟南芥、歐洲油菜等植物的逆境應答中發揮重要作用。
前期研究發現，與野生型相比，CYP90B1轉基因植株在低溫、鹽等逆境脅迫條件下的生理抗性指數及活力明顯升高，且CYP90B1可提高植株對幹旱、鹽等脅迫的抗性，進而增加植株的産量。
實驗在獲得課題組前期萱草轉錄組資料基礎上，以成功克隆出萱草屬CYP家族的CYP90B1基因為切入點，全長838bp，并進行了蛋白質結構預測和功能分析。
通過同源序列比對結果可得：HfCYP90B1與鳳梨同源基因蛋白序列相似度為74%，序列相似度很高，兩者功能可能具有相似性。
關于萱草CYP基因家族的功能研究相對較少，萱草是中國的重要觀賞植物，其産量和品質受多種生物和非生物因素影響。
前期通過轉錄組資料篩選，對萱草的CYP家族基因進行了鑒定、分類、命名，并利用生物資訊學方法對其理化特性進行了分析，目前尚無有關萱草CYP基因調節葉發育的研究報道。
CYP家族基因在植物葉片發育過程中具關鍵調節作用，由此可推測，HfCYP90B1基因參與調控了萱草葉片生長。
是以，對這一基因進行深入的生物資訊學研究，對于進一步研究其功能有十分重要的意義。綜上所述，本實驗的進行，将為萱草葉片形狀的遺傳改良，提供一定的科學依據。