文丨初八没烦恼
编辑丨初八没烦恼
萱草为阿福花科萱草属植物，是中国一种用途很广、兼具观赏和食用价值的传统花卉。
植物叶片，是植物进行光合作用的主要器官，其生长发育，主要由基因编程及环境两方面的调控共同决定。
细胞色素P450或称为CYPs，在450nm处有最大吸光度，是最大和最多样化的酶超家族之一。CYP90B1，又称DWF4。GhCYP90B1是一种棉花类固醇C22α-羟化酶基因。
CYPs广泛存在于生物体内，其主要功能为，代谢解毒及参与合成植物次级代谢产物等。
底物和功能的多样性是CYPs的特征，并被认为是不同生物体中，由不同的代谢或环境需求驱动，而进化适应的结果。
实验的材料与方法
主要试剂：RNA提取试剂盒，逆转录试剂盒，琼脂糖凝胶回收试剂盒，PCR试剂盒、大肠杆菌为TOP10感受态细胞、克隆载体为pMDTM18-T、BM2000DNAMarker。
将采集的萱草叶片样品放入液氮中进行研磨，提取总RNA，检测RNA的纯度及浓度。
cDNA第一链合成：RNA2μL、AccuRTReactionMix(4X)2μL、ddH2O4μL，42℃2min，再依次加入AccuRTReactionStopper(5x)2μL、5×All-In-OneRTMasterMix4μL、ddH2O6μL。
反应总体积20μL，25℃10min；42℃50min；85℃5min。逆转录后得到的cDNA保存于-20℃冰箱备用。
根据萱草转录组组装注释结果，设计HfCYP90B1基因PCR引物如下：F：ATGCTATCTGAACAGTTTAG；R：TCAGAGTTCAGCTGATATTG。
以上述cDNA为模板扩增候选基因的目的片段，扩增程序为：98℃3min；98℃10s，56℃30s，72℃90s，35个循环；72℃5min；保存于4℃。
扩增体系50μL：cDNA模板2μL，PremixTaq25μL，上、下游引物各1μL，余下用ddH2O补齐。利用DNA凝胶回收试剂盒，选取上述产物条带的长度与亮度均合适，则可进行胶回收。
回收后的产物与克隆载体pMDTM18-T连接，转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞内，涂布于带有氨苄的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养12h。
将核苷酸序列在ExPASy在线网站翻译成蛋白质序列；利用ProtParam在线软件预测蛋白序列的基本理化性质。
该蛋白质的亲/疏水性、亚细胞定位、信号肽与跨膜结构，主要通过protscale、WOLFPSORT、SignalP4.1和TMHMMServerv.2.0网站，进行预测分析。
利用NetPhos3.1在线网站对磷酸化位点进行预测；而HfCYP90B1蛋白的二级结构与三级结构预测，则分别通过SOPMA和SWISS-MODEL进行。
使用MEGA-X软件采用NJ法即邻接法，bootstrap值重复1000次，构建系统发育进化树。
利用实时荧光定量PCR仪对HfCYP90B1进行表达分析，3次生物学重复，3次技术重复，内参基因选择植物常用的ACT。
PCR反应体系：ChamQSYBRColorqPCRMasterMix16.5μL，cDNA模板2μL，ForwardPrimer0.8μL，ReversePrimer0.8μL，ddH2O14μL。
扩增程序：95℃5min，95℃5s，50℃30s，72℃40s，40个循环；保存于4℃。表达量的计算采用2-△△CT，对叶面积大和叶面积小的，HfCYP90B1基因表达量进行检测分析。
实验结果分析
植物CYPs可参与催化许多初级、次级代谢反应，在植物中起着重要的生物合成作用，它的反应底物，是类固醇等内源性化合物及外源物质等。
CYPs广泛存在于生物体内，其主要功能，为代谢解毒及参与合成植物次级代谢产物等。
底物和功能的多样性是CYPs的特征，并被认为是不同生物体中，由不同的代谢或环境需求驱动，而进化适应的结果。
以合成第一链cDNA为模板进行PCR扩增，对其产物进行检测，电泳结果表明，在750~1000bp有1条特异性条带，获得与预期产物长度相符的特异性条带，符合目标基因要求。
将该扩增产物胶回收、连接克隆载体，连接产物转化至感受态细胞大肠杆菌TOP10中，将连接后大肠杆菌进行平板涂布，并挑取单菌落并进行菌落PCR鉴定，将条带正确的送至生工进行测序验证。
经测序结果显示其产物长度为838bp，且与转录组组装序列完全一致，将该基因命名为HfCYP90B1。
对HfCYP90B1编码蛋白的理化性质利用蛋白组学分析平台ExPASy进行分析，结果为HfCYP90B1基因中含有氨基酸143个，分子式为C738H1162N200O198S8。
分子质量为16.26105kD，原子总数为2306，脂肪族指数为43.10，残基负电荷数Asp+Glu13个，残基正电荷数Arg+Lys17个，理论电点pI为9.12，则其为碱性蛋白。
该蛋白不稳定性指数II为43.10，则其为不稳定蛋白。亲水性平均系数为-0.026，则其为亲水性蛋白。基于此推测该蛋白为亲水性不稳定碱性蛋白。
通过Conserveddomains数据库对HfCYP90B1蛋白保守结构域进行分析，该蛋白存在1个特异位点Cypx，3个非特异位点CYP90-like、PLN02500、p450，属于p450、cytochrome-p450和Cypx超家族。
利用TMHMMServerv.2.0预测跨膜结构域结果显示：该蛋白整个序列都在膜外，无跨膜结构域，故不属于跨膜蛋白。
通过SignalP4.1Server在线网站以预测信号肽，结果表明：该蛋白不含有信号肽位点，故属于非分泌蛋白。
从WOLFPSORT在线网站预测亚细胞定位，结果表明：位于细胞质的系数为8，定位于叶绿体的系数为2，定位于细胞核、线粒体、过氧物酶体的系数为1。
通过NetPhos3.1Server在线网站预测磷酸化位点，发现HfCYP90B1共有15个蛋白磷酸化位点值>0.5，分别为10个丝氨酸位点和3个苏氨酸位点和2个酪氨酸位点。
对萱草HfCYP90B1氨基酸序列，共编码135个氨基酸，其中无规则卷曲含量最多为47.55%，而α-螺旋、延伸链和β-折叠含量，分别为30.07%、16.78%和5.59%。
通过同源建模方法预测HfCYP90B1蛋白的三维结构，HfCYP90B1以6a18.1.A蛋白为模板，用于建立该模型的氨基酸残基范围为1~139位，序列一致性为51.82%，序列相似度为46%。
利用HfCYP90B1基因序列构建的系统进化树，发现HfCYP90B1与其他植物物种基因具有同源性，HfCYP90B1与凤梨聚为同一支，同源性为74%。
将HfCYP90B1基因，在萱草K品种不同叶面积株系中的相对表达量进行比较，结果表明，HfCYP90B1基因，在K品种3株不同叶面积的萱草中相对表达量不同。
其在K1株系中相对表达量最高；在K3株系中相对表达量最低，约为K1株系的0.179倍，而在K2株系中的表达量约为K1株系的0.33倍。
HfCYP90B1基因在萱草中，相对表达量与叶面积变化趋势完全一致，即K1>K3>K2。
HfCYP90B1基因表达量在宽叶中，整体呈现出上调表达趋势。由此可以推测，HfCYP90B1基因极可能参与调控了萱草叶片生长。
实验结果讨论
研究表明，CYP450s可与多种底物发生相互作用，参与植物生长发育过程中的，多种次级代谢反应，对植物的生命网络系统具有重要的调控功能。
BRs对植物的开花时间、种子产量及抗逆性等重要的农艺性状均有调控作用；对植物的生长和发育也是必不可少的，并积极参与许多生理过程，增强了植物在逆境下的抗逆性。
在不受生长素、赤霉素和乙烯的作用下，能够促进叶柄伸长和叶片向上弯曲的过度增加。
除赤霉素、细胞分裂素、生长素、乙烯、脱落酸之外，油菜素甾醇被认为是第六大类植物内源性激素。
CYP90B1是C-22位羟化酶，因此也是BRs生物合成途径的关键限速酶，其催化反应是合成BRs的关键步骤，在BRs的生物合成途径中有重要调控作用。
过量表达CYP90B1可有效调节BRs的生物合成。DWF4基因能够提高玉米和拟南芥的产量。高温胁迫下，拟南芥CYP90B1基因表达上调，BRs含量升高。
在欧洲油菜中，表达了拟南芥BRs生物合成基因AtDWF4，发现BRs可以提高，非生物和生物胁迫的耐受性和植物的生产力。
以上研究结果均可证明CYP90B1基因能够通过调节内源BRs的生物合成量，进而促进植物生长、增加作物产量、提高植物的抗逆能力。
研究表明，CYP90B1参与调控玉米、拟南芥等植物的生长发育活动，并在拟南芥、欧洲油菜等植物的逆境应答中发挥重要作用。
前期研究发现，与野生型相比，CYP90B1转基因植株在低温、盐等逆境胁迫条件下的生理抗性指数及活力明显升高，且CYP90B1可提高植株对干旱、盐等胁迫的抗性，从而增加植株的产量。
实验在获得课题组前期萱草转录组数据基础上，以成功克隆出萱草属CYP家族的CYP90B1基因为切入点，全长838bp，并进行了蛋白质结构预测和功能分析。
通过同源序列比对结果可得：HfCYP90B1与凤梨同源基因蛋白序列相似度为74%，序列相似度很高，两者功能可能具有相似性。
关于萱草CYP基因家族的功能研究相对较少，萱草是中国的重要观赏植物，其产量和质量受多种生物和非生物因素影响。
前期通过转录组数据筛选，对萱草的CYP家族基因进行了鉴定、分类、命名，并利用生物信息学方法对其理化特性进行了分析，目前尚无有关萱草CYP基因调节叶发育的研究报道。
CYP家族基因在植物叶片发育过程中具关键调节作用，由此可推测，HfCYP90B1基因参与调控了萱草叶片生长。
因此，对这一基因进行深入的生物信息学研究，对于进一步研究其功能有十分重要的意义。综上所述，本实验的进行，将为萱草叶片形状的遗传改良，提供一定的科学依据。