文|胡叁叔
編輯|胡叁叔
前言
熒光PCR作為一種重要的生物資訊學分析手段，具有快速、靈敏、高選擇性、高通量等特點。
3-磷酸-脫氫酶，actin，微管蛋白，轉錄延伸因子，泛素連接配接酶等是目前研究最多的基因之一，在甜瓜，蘋果，櫻桃，梨，茶樹，大豆，洋芋等多種作物中都有大量的基因。
在理想狀态下，在不同品種、不同組織、不同發育階段等試驗條件下，内參考基因都能較為穩定地表達，但是其表達量也并非是固定的，是以要針對特定的條件，選擇合适的内參考基因。
桂圓是一種特有的熱帶、亞熱帶水果，具有較高的經濟和醫藥價值，目前國内外對其進行q-PCR定量分析的文獻有很多。
尋找到能夠保持穩定的内标基因，将其做為量化的基礎非常關鍵，Lin等選擇了18SRNA、UBQ、EF-1α等10個候選内标基因。
對它們在龍眼體細胞胚胎中的表達進行了分析，最後得到了UBQ和Fe-SOD是在不同溫度、不同發育階段條件下，最穩定的内标基因組合。
Wu等對12個候選内參考基因進行了轉錄組測序，并對其在6個不同發育階段的果皮和假種皮中的表達進行了分析，在此基礎上開展了基于内标基因的研究工作。
在前期工作基礎上，通過對不同時期的龍眼品種“石榴”、中晚熟品種“香酥”和“立冬”3個不同生長時期的果肉進行比較。
材料與方法
試驗材料取自于國家果樹種質福州龍眼圃，在果實膨大期及成熟期，分别選擇龍眼‘石硖’品種雌花開放後100d、110d、115d和120d。
‘香脆’及‘立冬本’品種雌花開放後，取其100d、110d、120d和130d的正常生長果實，剝取果肉将其用液氮速凍，錫箔紙包裝後置于超低溫冰箱中冷凍儲存備用。
利用Trizol方法，通過3%的瓊脂凝膠電泳對其進行了分析，采用GenStar公司反向錄試劑盒StarScriptIIFirst-strandcDNASynthesisKitwithgDNARemover，其具體操作遵循說明書中的步驟，在除去RNA中的基因組DNA後，将其反向錄成cDNA，放入-20℃的冰箱中進行低溫儲存。
本項目拟在前期工作基礎上，通過對龍眼全基因組的重測序和轉錄組分析，并綜合國内外相關文獻，選擇5個可能的内參照基因（EF-1α-1,EF-1α-2,Actin1,Actin2,GAPDH2）。
此外，還将對IPMS2和SS7進行功能鑒定，引物是在尚亞生物股份有限公司的PrimerPremier5.0的基礎上進行的，再以TB綠色組合物為模闆，應用CFXConnectFluorescencePCR技術，對該方法進行了驗證。
制備的反應系統20微升：1.0微升cDNA模闆，0.5微升正反向引物，10微升2xRealStarGreenFastMixtures,8微升ddH2O2。
本研究采用兩階段的方法，即在95℃進行2分鐘的預熱，1次循環；95℃15秒的變形，60℃40次的退火拉伸，15-30秒的變形，測定其熔化特性。
使用geNorm、NormFinder軟體，對内參考基因的穩定值進行對比，并進行基因數目的篩選，再使用BestKeeper軟體，對内參考基因的表達穩定性進行分析，最後使用ReFinder進行綜合評估，選擇出最優的内參考基因或組合。
結果與分析
采用Trizol方法對其進行了全RNA的提取，對其含量進行了測定，發現OD260/OD280和OD260/OD230分别為1.9和2.1。
在3%瓊脂糖凝膠電泳圖譜上，包含了28SRNA和18SRNA2條帶，并且條帶非常的清晰；而且它們的完整度較高，基本無降解，亮度在2∶1和1∶1之間，這就滿足了後續試驗對RNA的純度和濃度的要求。
在“石榴”果實的各個生長階段，5對引物的溶解曲線具有顯著的單峰性，并且通過瓊脂凝膠電泳的測定結果表明，PCR的放大結果具有特異性，并且與期望的尺寸一緻。
内參基因的Ct值是衡量某一基因表達量的主要名額，Ct值越大，基因表達量越低；反之越高。
q-PCR的結果在各種樣本中，内參基因EF-1α-1的Ct值範圍為22~31,EF-1α-2的Ct值範圍為23~31,Actin1的Ct值範圍為24~33,Actin2的Ct值範圍為22~30,GAPDH2的Ct值範圍為19~26。
這表示5個内參基因在所有的龍眼樣本中都有表達，但GAPDH2表達量較高，Actin1表達量較低。
geNorm軟體預設M=1.5作為評估門檻值，M值越大，穩定性越低，反之越高。
用geNorm軟體對各個基因的M值的大小進行了分析，可以得到5個内參基因的穩定性在不同的龍眼品種的果實發育過程中有着一定的差别，但是EF-1α-1、EF-1α-2在3個品種中的表達最穩定。
Vn/（n+1）都超過了0.15，這時候不能僅僅憑借門檻值（0.15）來對合适的内标基因的數量進行判定，需要與後續的軟體結果相結合，對其進行深入的篩選。
NormFinder軟體生成基因表達的穩定值，基因越穩定則數值越低，以此來對内參基因進行篩選。
NormFinder分析表明，EFF-alpha-2在“白花”果實的生長過程中表現得最好，其次是EFF-alpha-1，GAPDH2在“香酥”中的表現最好，EF-1α-2次之；在‘立冬本’中EF-1α-1表達最穩定，EF-1α-2次之。
BestKeeper是用對樣本的平均Ct值進行分析對比來評估内标基因的穩定性，Ct值的标準差和變異系數越小則基因的穩定性越好。
結果表明在‘石硖’和‘立冬本’中表達最穩定的基因為Actin1，而在‘香脆’中最穩定的為EF-1α-1，這與geNorm和NormFinder軟體分析結果存在差異。
使用ReFinder軟體對5個内參考基因進行了全面的分析，發現5個内參考基因在3個龍眼品種果實不同生長階段的穩定性依次為：EF-1alpha-1>EF-1alpha-2>Actin2>GAPDH2>Actin1。
将這3種軟體的結果進行了對比，最終選出了表現比較穩定的内參考基因EF-1alpha-1,EF-1alpha-2和Actin2。
通過q-PCR技術，篩選出與蘋果酸合成相關的IPMS2和蔗糖合成相關的SS72個關鍵酶，并利用EF-1alpha-1和Actin2雙核心酶，對其在q-PCR中的表達量進行檢測。
IPMS2和SS7在三個不同時期的表達模式是一樣的，都是先下降後上升的，并且在雌花120天後達到了最高點。
是以，EF-1alpha-1與Actin2均适用于對其進行雙内參照基因的定量研究。
小結與讨論
經典的内參考蛋白和Actin是生物合成過程中最關鍵的分子，它們在生理和病理條件下都具有較高的特異性和穩定性。
在大花紅景天和鐵皮石斛中，GAPDH在兩種植物中均有穩定的表達，且在逆境條件下均有較好的表達；ACT、EFF-alpha、GAPDH和SAND在果實組織中都有較好的表達。
在對荔枝進行内參基因的選擇上，魏永贊等人從6種常見的内參基因中，選出了一種在荔枝果實各發育時期和在外加生長調節因子的作用下，表現最為穩定的内參基因beta-actin。
通過對7個内參考基因的分析，我們發現EF-1α、Actin在荔枝各生長時期均能過量表達，而GAPDH、EF-1α均能過量表達。
申請人在前期工作中，通過對以上文獻17-19中EF1α、Actin1、Actin2、GAPDH2等内參考基因進行了初步實驗，發現隻有Actin1、GAPDH2得到的條帶特異性較高，尺寸與期望一緻，說明在實驗過程中需要對适合的内參考基因進行篩選。
轉錄組學技術在很多物種的q-PCR分析中發揮了很大的作用，在非洲油棕榈屬植物中，同屬一個基因家族的不同基因間也會有一些相似之處。
比如Xia等人從多個不同的轉錄組中發現了一個在低溫、幹旱、高鹽脅迫下表現出相對穩定的管家基因（ACT)。
其中ACT家族中的ACT1、ACT2以及EIF家族中的EIF1、EIF2都是在低溫、幹旱、高鹽脅迫下表現出相對穩定的内參照基因。
我們前期通過對EF-1a及Actin2基因的分析，發現了6個EF-1a及Actin2基因，并通過q-PCR驗證獲得了兩個FPKM表達量變化不大的基因。
是以，在未來的研究中，我們可以通過多個時間和空間上的高通量測序，挖掘出更多的内參考基因。
因為Vn/n+1>0.15不能直接判斷出合适内參考基因的數量，是以還需要與其它軟體相配合對其進行全面的分析。
NormFinder軟體的結果與geNorm類似，但BestKeeper的結果顯示EF-1alpha-1和Actin1是最穩定的。
蔣婷婷等從不同組織和不同生長階段的小球莖葉中，尋找最适合的内參照基因時，得到了相似的結論。
最後作者利用ReFinder軟體對其進行了全面評價，發現EF-1α-1、EF-1α-2及Actin2的表達量最為穩定。
Actin2還能在果皮、果肉、花芽和籽粒中穩定地表達。
參考文獻：
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