文|胡叁叔
编辑|胡叁叔
前言
荧光PCR作为一种重要的生物信息学分析手段，具有快速、灵敏、高选择性、高通量等特点。
3-磷酸-脱氢酶，actin，微管蛋白，转录延伸因子，泛素连接酶等是目前研究最多的基因之一，在甜瓜，苹果，樱桃，梨，茶树，大豆，土豆等多种作物中都有大量的基因。
在理想状态下，在不同品种、不同组织、不同发育阶段等试验条件下，内参考基因都能较为稳定地表达，但是其表达量也并非是固定的，所以要针对特定的条件，选择合适的内参考基因。
桂圆是一种特有的热带、亚热带水果，具有较高的经济和医药价值，目前国内外对其进行q-PCR定量分析的文献有很多。
寻找到能够保持稳定的内标基因，将其做为量化的基础非常关键，Lin等选择了18SRNA、UBQ、EF-1α等10个候选内标基因。
对它们在龙眼体细胞胚胎中的表达进行了分析，最后得到了UBQ和Fe-SOD是在不同温度、不同发育阶段条件下，最稳定的内标基因组合。
Wu等对12个候选内参考基因进行了转录组测序，并对其在6个不同发育阶段的果皮和假种皮中的表达进行了分析，在此基础上开展了基于内标基因的研究工作。
在前期工作基础上，通过对不同时期的龙眼品种“石榴”、中晚熟品种“香酥”和“立冬”3个不同生长时期的果肉进行比较。
材料与方法
试验材料取自于国家果树种质福州龙眼圃，在果实膨大期及成熟期，分别选择龙眼‘石硖’品种雌花开放后100d、110d、115d和120d。
‘香脆’及‘立冬本’品种雌花开放后，取其100d、110d、120d和130d的正常生长果实，剥取果肉将其用液氮速冻，锡箔纸包装后置于超低温冰箱中冷冻保存备用。
利用Trizol方法，通过3%的琼脂凝胶电泳对其进行了分析，采用GenStar公司反向录试剂盒StarScriptIIFirst-strandcDNASynthesisKitwithgDNARemover，其具体操作遵循说明书中的步骤，在除去RNA中的基因组DNA后，将其反向录成cDNA，放入-20℃的冰箱中进行低温保存。
本项目拟在前期工作基础上，通过对龙眼全基因组的重测序和转录组分析，并综合国内外相关文献，选择5个可能的内参照基因（EF-1α-1,EF-1α-2,Actin1,Actin2,GAPDH2）。
此外，还将对IPMS2和SS7进行功能鉴定，引物是在尚亚生物股份有限公司的PrimerPremier5.0的基础上进行的，再以TB绿色组合物为模板，应用CFXConnectFluorescencePCR技术，对该方法进行了验证。
制备的反应系统20微升：1.0微升cDNA模板，0.5微升正反向引物，10微升2xRealStarGreenFastMixtures,8微升ddH2O2。
本研究采用两阶段的方法，即在95℃进行2分钟的预热，1次循环；95℃15秒的变形，60℃40次的退火拉伸，15-30秒的变形，测定其熔化特性。
使用geNorm、NormFinder软件，对内参考基因的稳定值进行对比，并进行基因数目的筛选，再使用BestKeeper软件，对内参考基因的表达稳定性进行分析，最后使用ReFinder进行综合评估，选择出最优的内参考基因或组合。
结果与分析
采用Trizol方法对其进行了全RNA的提取，对其含量进行了测定，发现OD260/OD280和OD260/OD230分别为1.9和2.1。
在3%琼脂糖凝胶电泳图谱上，包含了28SRNA和18SRNA2条带，并且条带非常的清晰；而且它们的完整度较高，基本无降解，亮度在2∶1和1∶1之间，这就满足了后续试验对RNA的纯度和浓度的要求。
在“石榴”果实的各个生长阶段，5对引物的溶解曲线具有显著的单峰性，并且通过琼脂凝胶电泳的测定结果表明，PCR的放大结果具有特异性，并且与期望的尺寸一致。
内参基因的Ct值是衡量某一基因表达量的主要指标，Ct值越大，基因表达量越低；反之越高。
q-PCR的结果在各种样本中，内参基因EF-1α-1的Ct值范围为22~31,EF-1α-2的Ct值范围为23~31,Actin1的Ct值范围为24~33,Actin2的Ct值范围为22~30,GAPDH2的Ct值范围为19~26。
这表示5个内参基因在所有的龙眼样本中都有表达，但GAPDH2表达量较高，Actin1表达量较低。
geNorm软件默认M=1.5作为评估阈值，M值越大，稳定性越低，反之越高。
用geNorm软件对各个基因的M值的大小进行了分析，可以得到5个内参基因的稳定性在不同的龙眼品种的果实发育过程中有着一定的差别，但是EF-1α-1、EF-1α-2在3个品种中的表达最稳定。
Vn/（n+1）都超过了0.15，这时候不能仅仅凭借阈值（0.15）来对合适的内标基因的数量进行判定，需要与后续的软件结果相结合，对其进行深入的筛选。
NormFinder软件生成基因表达的稳定值，基因越稳定则数值越低，以此来对内参基因进行筛选。
NormFinder分析表明，EFF-alpha-2在“白花”果实的生长过程中表现得最好，其次是EFF-alpha-1，GAPDH2在“香酥”中的表现最好，EF-1α-2次之；在‘立冬本’中EF-1α-1表达最稳定，EF-1α-2次之。
BestKeeper是用对样本的平均Ct值进行分析对比来评估内标基因的稳定性，Ct值的标准差和变异系数越小则基因的稳定性越好。
结果表明在‘石硖’和‘立冬本’中表达最稳定的基因为Actin1，而在‘香脆’中最稳定的为EF-1α-1，这与geNorm和NormFinder软件分析结果存在差异。
使用ReFinder软件对5个内参考基因进行了全面的分析，发现5个内参考基因在3个龙眼品种果实不同生长阶段的稳定性依次为：EF-1alpha-1>EF-1alpha-2>Actin2>GAPDH2>Actin1。
将这3种软件的结果进行了对比，最终选出了表现比较稳定的内参考基因EF-1alpha-1,EF-1alpha-2和Actin2。
通过q-PCR技术，筛选出与苹果酸合成相关的IPMS2和蔗糖合成相关的SS72个关键酶，并利用EF-1alpha-1和Actin2双核心酶，对其在q-PCR中的表达量进行检测。
IPMS2和SS7在三个不同时期的表达模式是一样的，都是先下降后上升的，并且在雌花120天后达到了最高点。
因此，EF-1alpha-1与Actin2均适用于对其进行双内参照基因的定量研究。
小结与讨论
经典的内参考蛋白和Actin是生物合成过程中最关键的分子，它们在生理和病理条件下都具有较高的特异性和稳定性。
在大花红景天和铁皮石斛中，GAPDH在两种植物中均有稳定的表达，且在逆境条件下均有较好的表达；ACT、EFF-alpha、GAPDH和SAND在果实组织中都有较好的表达。
在对荔枝进行内参基因的选择上，魏永赞等人从6种常见的内参基因中，选出了一种在荔枝果实各发育时期和在外加生长调节因子的作用下，表现最为稳定的内参基因beta-actin。
通过对7个内参考基因的分析，我们发现EF-1α、Actin在荔枝各生长时期均能过量表达，而GAPDH、EF-1α均能过量表达。
申请人在前期工作中，通过对以上文献17-19中EF1α、Actin1、Actin2、GAPDH2等内参考基因进行了初步实验，发现只有Actin1、GAPDH2得到的条带特异性较高，尺寸与期望一致，说明在实验过程中需要对适合的内参考基因进行筛选。
转录组学技术在很多物种的q-PCR分析中发挥了很大的作用，在非洲油棕榈属植物中，同属一个基因家族的不同基因间也会有一些相似之处。
比如Xia等人从多个不同的转录组中发现了一个在低温、干旱、高盐胁迫下表现出相对稳定的管家基因（ACT)。
其中ACT家族中的ACT1、ACT2以及EIF家族中的EIF1、EIF2都是在低温、干旱、高盐胁迫下表现出相对稳定的内参照基因。
我们前期通过对EF-1a及Actin2基因的分析，发现了6个EF-1a及Actin2基因，并通过q-PCR验证获得了两个FPKM表达量变化不大的基因。
因此，在未来的研究中，我们可以通过多个时间和空间上的高通量测序，挖掘出更多的内参考基因。
因为Vn/n+1>0.15不能直接判断出合适内参考基因的数量，所以还需要与其它软件相配合对其进行全面的分析。
NormFinder软件的结果与geNorm类似，但BestKeeper的结果显示EF-1alpha-1和Actin1是最稳定的。
蒋婷婷等从不同组织和不同生长阶段的小球茎叶中，寻找最适合的内参照基因时，得到了相似的结论。
最后作者利用ReFinder软件对其进行了全面评价，发现EF-1α-1、EF-1α-2及Actin2的表达量最为稳定。
Actin2还能在果皮、果肉、花芽和籽粒中稳定地表达。
参考文献：
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［2］章丽珍,韩晓云,吴菁华,GefuWANG-PRUSKI,张志忠《甜瓜实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选》
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［4］朱友银,王月,张弘,邵姁,李永强,郭卫东《中国樱桃实时定量PCR(qRT-PCR)内参基因的筛选与鉴定》