文|胡叁叔
编辑|胡叁叔
前言
镉不但是一种对人类健康有着意义重大的微量元素，它还在金属冶炼、塑料加工、涂料、电池等领域有着重要的应用前景。
Cd是世界上最重要的环境污染物，作为人类非必须元素，它已被列入世界首位Cd类污染物。
在长江和东南海岸PM10中，Cd的平均浓度为0.52mg/kg，超出了GB15618-2018《农用地土壤污染风险管控标准(试行)》的限制值（0.30mg/kg）。
Cd难以被生物降解，会随着废水和废气不断向大气释放，造成越来越多的生态问题。
调查显示，镉暴露不仅会对胎盘的发育功能造成不利影响，还会通过胎盘进入到胎儿身体中，对胎儿正常生长、认知能力等造成严重影响。
在较低浓度的镉环境中，会导致小鼠的肠道菌群发生变化，加快肝脏的脂肪代谢，导致终身代谢紊乱。
长时间的镉溶液暴露，会活化玉米螟幼虫的金属硫蛋白基因Mtn表达，同时还会对抗氧化基因Cat和GPx表达进行抑制。
在此过程中，果蝇体内的脂质过氧化反应也会明显增加，从而使其生长速率和存活率下降。
重金属污染会使果蝇的体长变短、体重变轻，并使baz、tj等生长有关基因的表达受到抑制，而这种效应又会将其传递到没有污染的子代。
由于在体外可以进行发育，而且发育速度快，并且胚胎透明，所以被广泛应用到了环境中。
斑马鱼胚胎对重金属比较敏感，在3.00mg/L的环境中，96h会引起胚胎孵化延迟，出现小头、心率降低、体节缺失，并且对外部环境不敏感。
此外，重金属还会对胚胎atp2b1a、pth1、stc1等，与Ca2+调控有关基因的表达产生抑制作用，从而对胚胎的耳石发育造成影响。
材料与方法
在中国海洋生物研究所的循环水饲养体系下，从中国国际斑马鱼种库引进了AB类的野生斑马鱼种库，pH值在7±0.5之间。
光暗循环为14小时/10小时；每天早上和晚上喂养两次，在出生的前一天，雄性和雌性以2:1的比率，放置在产卵箱中来采集受精卵，而胚胎则是在ISO15088规定的水中进行培育，根据斑马鱼的胚胎发育阶段来划分。
本项目拟采用北京金唯智测序有限公司对以上基因进行扩增和回收，并将其与T型基因进行序列比对，筛选和培养出阳性病原菌，并分离出相应的基因，对目标基因进行序列测定和分析。
依照OECD236标准方法，设定5个浓度，然后计算出镉的半致死剂量。
以LC50数据为依据，将暴露组CdCl2浓度设定为7.50mg/L。
在将胎儿放在生物培养箱28.5℃下培养2~4h之后，选择发育正常的胎儿展开暴露试验，暴露时间为4~48hpf。
遵循实验室建立的方法，展开原位杂交试验，也就是用限制性内切酶酶切回收目标基因，用SP6/T7转录酶合成插入高辛标记的RNA探针，将其溶解在50μL杂交液中，并保存于备用。
以48hpf对照组及60只Cd染毒的斑马鱼为研究对象，用TRLzol萃取总RNA，反转录为cDNA，3次生物反复3次，以95℃2分钟为反应温度，进行荧光PCR。
在95℃下30秒、55℃下30秒、72℃下1分钟，共30个循环周期；在72℃下保持5分钟、4℃下保持30秒，表1中给出了这些引物的顺序。
使用IBMSPSS20软件展开统计分析，并计算出镉的LC50及95%可信区间，再使用GraphPadPrism8、One-wayANOVA软件，对目标基因的表达差异展开分析。
结果与讨论
用暴露测试的方法，可以计算出镉暴露对斑马鱼胚胎120hpf的半致命浓度，同时还可以用体视显微镜，观察到斑马鱼胚胎发育的毒性效应。
以3次重复实验结果为基础，构建出镉的剂量与效应关系曲线，可以看图1(a)，在胚胎死亡率达到50%的时候，所对应的镉浓度为15.20mg/L。
暴露于20.00mg/L镉4~48hpf的斑马鱼胚胎会出现头部和眼睛变小、体长缩短、躯干弯曲、卵黄囊异常以及心脏发育不良等畸形形态。
研究表明，在正常胎儿中，Prdx1下丘脑、鼻腔、心包区和上皮细胞中有显著差异，下颌、鼻腔、侧线和血液中也有显著差异。
对照组胚胎prdx1基因主要在下丘脑表达〔见图2和图3(a)〕，镉暴露导致prdx1基因在嗅球、侧线器官和上皮细胞的异常表达〔见图2和图3(a′)〕。
在镉的照射下，prdx1、gstp1.2、atf3、jdp2b、hsp70l、eif4a1b和fabp7a基因的相对表达量明显上调，它们的水平分别提高了2.31、3.58、2.08、3.42、5.27、1.42和2.06倍（见图4）。
hsp70l基因主要涉及到应激和对金属离子的响应、gstp1.2和prdx1基因涉及到抗氧化，atf3和jdp2b基因为DNA结合转录因子。
从这些基因的明显上调可以看出，镉会对斑马鱼胚胎的氧化应激、转录翻译和早期神经发育等过程产生影响。
有报道称，镉主要是以芬顿反应取代了金属离子，从而引起氧化应激，并引起机体的氧化应激和钙盐转运，对蛋白质的正常生理功能等产生不良影响。
申请人前期对8个基因进行了初步分析，发现5个基因在镉处理后，斑马鱼幼虫的嗅球上出现了异常表达量，并对其进行初步分析，证实了4个基因在镉处理后，斑马鱼幼虫中的表达量明显增高。
这5个基因中，有5个在镉处理后，斑马鱼幼虫在嗅球上出现了异常的表达量，并对细胞的代谢、解毒和抗癌起着关键作用。
实验结果表明，Cd可以抑制眼球内皮生长和视网膜神经元增殖。
镉通过阻断神经嵴的形成、抑制视网膜神经元的分化、破坏视网膜神经节细胞的轴突形成等过程，影响斑马鱼胚胎眼睛的发育。
本项目拟在前期工作基础上，以Cd处理后的斑马鱼晶状体内eif4a1b和hsp90aa11为切入点，深入探讨Cd对晶体结构的影响。
Fabp7a在中枢及视网膜均有高水平的表达，调节眼球发育。
因此，Cd处理可引起FabP7a蛋白水平明显升高，但Cd处理能否引起CNS及RNA-seq等方面的变化尚不清楚。
结论
20mg/LCd染毒后，斑马鱼胎儿发生畸形、头部小、眼睛小、躯干弯曲、心包水肿、卵黄囊畸形，经测定，它在染毒120h后，LC50含量为15.20mg/L。
7.50mg/L镉诱导prdx1、gstp1.2、atf3、jdp2b、hsp70l、eif4a1b和fabp7a基因的表达量显著上升，说明镉可能影响斑马鱼胚胎的氧化应激、转录翻译和早期神经发育等过程。
在神经组织、视网膜、晶状体、嗅球、侧线、心脏、皮肤等组织器官中，7.50mg/LCd可以引起该基因的异常表达，这表明Cd对该基因的表达区有一定作用。
这些都对斑马鱼的多种组织和器官产生了影响，从而导致其嗅觉、视觉、运动等方面的障碍。
参考文献：
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