文|胡叁叔
編輯|胡叁叔
前言
镉不但是一種對人類健康有着意義重大的微量元素，它還在金屬冶煉、塑膠加工、塗料、電池等領域有着重要的應用前景。
Cd是世界上最重要的環境污染物，作為人類非必須元素，它已被列入世界首位Cd類污染物。
在長江和東南海岸PM10中，Cd的平均濃度為0.52mg/kg，超出了GB15618-2018《農用地土壤污染風險管控标準(試行)》的限制值（0.30mg/kg）。
Cd難以被生物降解，會随着廢水和廢氣不斷向大氣釋放，造成越來越多的生态問題。
調查顯示，镉暴露不僅會對胎盤的發育功能造成不利影響，還會通過胎盤進入到胎兒身體中，對胎兒正常生長、認知能力等造成嚴重影響。
在較低濃度的镉環境中，會導緻小鼠的腸道菌群發生變化，加快肝髒的脂肪代謝，導緻終身代謝紊亂。
長時間的镉溶液暴露，會活化玉米螟幼蟲的金屬硫蛋白基因Mtn表達，同時還會對抗氧化基因Cat和GPx表達進行抑制。
在此過程中，果蠅體内的脂質過氧化反應也會明顯增加，進而使其生長速率和存活率下降。
重金屬污染會使果蠅的體長變短、體重變輕，并使baz、tj等生長有關基因的表達受到抑制，而這種效應又會将其傳遞到沒有污染的子代。
由于在體外可以進行發育，而且發育速度快，并且胚胎透明，是以被廣泛應用到了環境中。
斑馬魚胚胎對重金屬比較敏感，在3.00mg/L的環境中，96h會引起胚胎孵化延遲，出現小頭、心率降低、體節缺失，并且對外部環境不敏感。
此外，重金屬還會對胚胎atp2b1a、pth1、stc1等，與Ca2+調控有關基因的表達産生抑制作用，進而對胚胎的耳石發育造成影響。
材料與方法
在中國海洋生物研究所的循環水飼養體系下，從中國國際斑馬魚種庫引進了AB類的野生斑馬魚種庫，pH值在7±0.5之間。
光暗循環為14小時/10小時；每天早上和晚上喂養兩次，在出生的前一天，雄性和雌性以2:1的比率，放置在産卵箱中來采集受精卵，而胚胎則是在ISO15088規定的水中進行培育，根據斑馬魚的胚胎發育階段來劃分。
本項目拟采用北京金唯智測序有限公司對以上基因進行擴增和回收，并将其與T型基因進行序列比對，篩選和培養出陽性病原菌，并分離出相應的基因，對目标基因進行序列測定和分析。
依照OECD236标準方法，設定5個濃度，然後計算出镉的半緻死劑量。
以LC50資料為依據，将暴露組CdCl2濃度設定為7.50mg/L。
在将胎兒放在生物培養箱28.5℃下培養2~4h之後，選擇發育正常的胎兒展開暴露試驗，暴露時間為4~48hpf。
遵循實驗室建立的方法，展開原位雜交試驗，也就是用限制性内切酶酶切回收目标基因，用SP6/T7轉錄酶合成插入高辛标記的RNA探針，将其溶解在50μL雜交液中，并儲存于備用。
以48hpf對照組及60隻Cd染毒的斑馬魚為研究對象，用TRLzol萃取總RNA，反轉錄為cDNA，3次生物反複3次，以95℃2分鐘為反應溫度，進行熒光PCR。
在95℃下30秒、55℃下30秒、72℃下1分鐘，共30個循環周期；在72℃下保持5分鐘、4℃下保持30秒，表1中給出了這些引物的順序。
使用IBMSPSS20軟體展開統計分析，并計算出镉的LC50及95%可信區間，再使用GraphPadPrism8、One-wayANOVA軟體，對目标基因的表達差異展開分析。
結果與讨論
用暴露測試的方法，可以計算出镉暴露對斑馬魚胚胎120hpf的半緻命濃度，同時還可以用體視顯微鏡，觀察到斑馬魚胚胎發育的毒性效應。
以3次重複實驗結果為基礎，建構出镉的劑量與效應關系曲線，可以看圖1(a)，在胚胎死亡率達到50%的時候，所對應的镉濃度為15.20mg/L。
暴露于20.00mg/L镉4~48hpf的斑馬魚胚胎會出現頭部和眼睛變小、體長縮短、軀幹彎曲、卵黃囊異常以及心髒發育不良等畸形形态。
研究表明，在正常胎兒中，Prdx1下丘腦、鼻腔、心包區和上皮細胞中有顯著差異，下颌、鼻腔、側線和血液中也有顯著差異。
對照組胚胎prdx1基因主要在下丘腦表達〔見圖2和圖3(a)〕，镉暴露導緻prdx1基因在嗅球、側線器官和上皮細胞的異常表達〔見圖2和圖3(a′)〕。
在镉的照射下，prdx1、gstp1.2、atf3、jdp2b、hsp70l、eif4a1b和fabp7a基因的相對表達量明顯上調，它們的水準分别提高了2.31、3.58、2.08、3.42、5.27、1.42和2.06倍（見圖4）。
hsp70l基因主要涉及到應激和對金屬離子的響應、gstp1.2和prdx1基因涉及到抗氧化，atf3和jdp2b基因為DNA結合轉錄因子。
從這些基因的明顯上調可以看出，镉會對斑馬魚胚胎的氧化應激、轉錄翻譯和早期神經發育等過程産生影響。
有報道稱，镉主要是以芬頓反應取代了金屬離子，進而引起氧化應激，并引起機體的氧化應激和鈣鹽轉運，對蛋白質的正常生理功能等産生不良影響。
申請人前期對8個基因進行了初步分析，發現5個基因在镉處理後，斑馬魚幼蟲的嗅球上出現了異常表達量，并對其進行初步分析，證明了4個基因在镉處理後，斑馬魚幼蟲中的表達量明顯增高。
這5個基因中，有5個在镉處理後，斑馬魚幼蟲在嗅球上出現了異常的表達量，并對細胞的代謝、解毒和抗癌起着關鍵作用。
實驗結果表明，Cd可以抑制眼球内皮生長和視網膜神經元增殖。
镉通過阻斷神經嵴的形成、抑制視網膜神經元的分化、破壞視網膜神經節細胞的軸突形成等過程，影響斑馬魚胚胎眼睛的發育。
本項目拟在前期工作基礎上，以Cd處理後的斑馬魚晶狀體内eif4a1b和hsp90aa11為切入點，深入探讨Cd對晶體結構的影響。
Fabp7a在中樞及視網膜均有高水準的表達，調節眼球發育。
是以，Cd處理可引起FabP7a蛋白水準明顯升高，但Cd處理能否引起CNS及RNA-seq等方面的變化尚不清楚。
結論
20mg/LCd染毒後，斑馬魚胎兒發生畸形、頭部小、眼睛小、軀幹彎曲、心包水腫、卵黃囊畸形，經測定，它在染毒120h後，LC50含量為15.20mg/L。
7.50mg/L镉誘導prdx1、gstp1.2、atf3、jdp2b、hsp70l、eif4a1b和fabp7a基因的表達量顯著上升，說明镉可能影響斑馬魚胚胎的氧化應激、轉錄翻譯和早期神經發育等過程。
在神經組織、視網膜、晶狀體、嗅球、側線、心髒、皮膚等組織器官中，7.50mg/LCd可以引起該基因的異常表達，這表明Cd對該基因的表達區有一定作用。
這些都對斑馬魚的多種組織和器官産生了影響，進而導緻其嗅覺、視覺、運動等方面的障礙。
參考文獻：
[1]張元元，郭少娟，王菲菲，等《TCDD和汞、鎬、鉛、砷聯合毒性效應及機理研究進展》
[2]蘇傳福《鍋對水生動物危害作用的研究進展》
[3]鄧紹坡，駱永明，宋靜，等《電子廢棄物拆解地PM、中多氯聯苯、鍋和銅含量調查及人體健康風險評估》
[4]于靖靖，師華定，王明浩，等《湘江子流域重點污染企業影響區土壤重金屬鍋污染源識别》