前言
細菌對多種抗生素産生快速耐性的問題已成為全球公共關注的焦點。從利比亞不同地區的土壤中分離并篩選了放線菌，以評估它們對細菌和真菌的抑制活性。共采集了300個土壤樣本，來自77個不同的生态系統，包括沙漠、森林、牧場和農田，分布在利比亞不同氣候地區。總共獲得了164個放線菌分離物。其中38個（23.2％）分離物通過孢子鍊和表面形态學、空氣和基質菌絲以及可溶性色素的形态學和顯微鏡學特征進行了初步鑒定。
初步分類結果顯示，所有分離物屬于鍊黴菌屬。随後對這些分離物進行了抗菌潛能的測試，針對九種細菌和真菌。在38個分離物中，有11個（28.9％）分離物顯示出對至少兩種測試菌株産生抑制物質的能力。在細菌菌株中，金黃色葡萄球菌對這十一個分離物幾乎全部敏感（90.9％），而鍊球菌對大多數標明的分離物表現出耐性（18.2％）。其中，來自沙漠地帶Wadan土壤的分離物編号063是唯一一株對所有測試的原微生物都表現出廣譜抗菌活性的分離物。
根據其培養、形态、生理和生化特性，将063号分離物鑒定為羅奇鍊黴菌。利比亞的土壤，尤其是在極端環境中，可能是具有抗微生物活性的生物活性物質的潛在來源。建議在利比亞未被開發和利用的未知地區探索新的栖息地，這可能為治療應用提供有前景的生物活性化合物資源。
具備強效抗微生物活性的生物寶庫
土壤是一種高度被開發的生态位，其居民産生各種生物活性天然化合物，包括對臨床有意義的抗生素。大多數抗微生物是由放線菌和真菌的天然産物衍生而來。在這些屬中，鍊黴菌在土壤中特别普遍。鍊黴菌屬成員是革蘭氏陽性、需氧的土壤居民，在自然界廣泛分布，是大多數土壤中微生物群落的重要組成部分。
放線菌的最有益和重要特性之一是它們能夠産生抗生素和其他次生代謝産物，這些化合物表現出各種生物活性，如抗菌、抗真菌、細胞毒性、細胞抑制、 抗氧化、色素和酶等。放線菌産生的物質具有多樣的化學結構，包括大環内酯類、四環素類、氨基糖苷類、糖肽類和茚環類物質。
盡管這些生物活性非常重要，但由放線菌産生的大量次生代謝産物因細菌的出現而失去了效力。迫切需要從尚未被開發用于農業和工業應用的新物種的放線菌中發現和開發獨特的生物活性物質。此外，放線菌的生物活性可能會因土壤類型及其組成而異。
利比亞的土壤由于其廣闊而大部分未被探索的地區，可能提供發現新放線菌的巨大潛力。是以，探索新的地區并開發創新技術以發現具有強效抗微生物活性的新放線菌已變得越來越迫切。從利比亞土壤中分離、檢測和表征放線菌，作為生物活性代謝産物的關鍵來源。
土壤樣本中利比亞放線菌的抗菌活性
共從利比亞各個氣候地區的77個不同生态系統中随機采集了300個土壤樣本，包括沙漠、森林、農田和牧場。在采集土壤時，考慮了人口密集和人口稀少的地區。土壤樣本是在2006年12月至2007年7月的六個月期間獲得的。在去除松散表面凋落物層後，從10厘米深度處擷取土壤樣本，将其放入無菌試管中，密封并在篩選之前儲存在4℃下。
采用以下放線菌分離方法。使用的培養基為Shirling和Gottlieb推薦的培養基。放線菌是利用土壤稀釋平闆法和酵母提取物-麥芽提取物瓊脂（ISP2）來純化放線菌分離物斜面的。将1克幹燥土壤放入9毫升蒸餾水中，攪拌15分鐘，然後讓懸浮液靜置15分鐘。含有10^-4 - 10^-6稀釋土壤樣品的試管放入45°C水浴中培養16小時，使孢子與營養細胞分離，然後将稀釋液接種在放線菌分離瓊脂平闆的表面上。標明的放線菌菌落轉移到瓊脂平闆上，在28°C下培養7 - 14天。
使用的測試微生物包括表皮葡萄球菌 (Staph. epidermidis) ATCC 12228、金黃色葡萄球菌 (Staph. aureus) ATCC 29737、枯草芽孢杆菌 (B. subtilis) ATCC 6633、鍊球菌 (Strep. pyogenes) DSM 2072、菲氏分枝杆菌 (Mycob. phlei) EMCC 1113、大腸杆菌 (E. coli) DSM 498、沙門氏菌 (Sal. enterica) ATCC 25566、白色念珠菌 (C. albicans) EMCC 105和黑曲黴 (A. niger) EMCC 132。這些微生物均來自埃及阿因謝姆斯大學農學院的MIRCEN Cairo。
通過瓊脂擴散法，測試放線菌分離物對標明微生物的抗菌活性 。将放線菌分離物在酵母提取物-麥芽提取物瓊脂（ISP2）上培養7 - 14天，在28°C下孵育。用直徑為9毫米的瓊脂圓片用無菌塞狀器剪下，轉移到先前接種了測試微生物的瓊脂平闆表面。對于表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大腸杆菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，使用營養瓊脂培養基。
對于鍊球菌，使用大豆胰蛋白胨瓊脂培養基。對于菲氏分枝杆菌，使用甘油土壤瓊脂培養基。對于白色念珠菌，使用沙氏葡萄糖瓊脂培養基。對于黑曲黴，使用洋芋葡萄糖瓊脂培養基。培養皿在30℃下孵育48小時，對于白色念珠菌和黑曲黴，對于其他測試微生物，如枯草芽孢杆菌、大腸杆菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、鍊球菌、菲氏分枝杆菌和沙門氏菌，則在37℃下孵育24小時。
在每個平闆上的菌落周圍存在明顯的透明環表示該菌落産生抗菌化合物的有效性。所有觀察和資料都被記錄下來。用于所有菌株形态學的标準培養基包括：酵母提取物-麥芽提取物瓊脂（ISP-2）；燕麥粥瓊脂（ISP-3）；無機鹽-澱粉瓊脂（ISP-4）；以及甘油-天冬氨酸瓊脂（ISP-5），這些都是由Shirling和Gottlieb使用的。另外還使用了葡萄糖-天冬氨酸瓊脂、賽貝克瓊脂、酪蛋白胨瓊脂（ISP-7）、營養瓊脂和Bennett瓊脂（葡萄糖-酪蛋白胨-酵母-牛肉瓊脂），這些都是根據Higgens和Kastner的方法。
在28℃下培養7 - 14天後，記錄了純分離物在各種培養基上的培養特性。通過使用Shirling和Göttlieb的方法進行顯微鏡觀察。使用不同瓊脂培養基來确定空氣菌絲、基質菌絲和可溶性色素的顔色。利用光學顯微鏡（美國紐約尼康公司）和透射電子顯微鏡（德國OberkochenZeiss EM-10）檢查生長在9種不同培養基（包括ISP 2、3、4、5和7，Bennett瓊脂、賽貝克瓊脂、葡萄糖-天冬氨酸瓊脂和營養瓊脂）上的7天、14天和21天培養的微觀形态學特征。
文化、形态學、生理學和生化學特征，将放線菌分離物鑒定到種屬水準。還進行了鍊黴菌的數值分類以鑒定所選分離物。利用孢子鍊形态、空氣和基質菌絲、可溶性色素、黑色素産生以及廣泛碳源的利用等方面的相似性和差異性，得到了各組。根據Trenser和Backus 的描述，将培養物配置設定到不同的系列（灰色（GY）、紅色（R）、黃色（Y）、藍色（B）、綠色（GN）、紫色（V）和白色（W））。
放線菌的分離
從利比亞的77個不同地點采集了300個土壤标本，得到了164株放線菌的分離物。在這164個分離物中，有38個（23.17%）進行了形态學特征的表征。然後對這些分離物進行了對七種細菌和兩種真菌菌株的抗微生物活性篩選。初步的抗微生物篩選顯示，在這38個分離物中，編号為07、010、025a、025b、037、057、062、063、067、069和071的分離物對至少一種被測試的微生物原體表現出抗微生物活性。
來自瓦丹市（沙漠地區）的編号為063的分離物表現出廣譜的抗微生物活性，對所有被測試微生物的抑制區直徑在10到15毫米之間。所有分離物對鍊球菌性原體均未表現出抗微生物活性，除了編号為25a和063的分離物。這些分離物對幾乎所有被測試的革蘭氏陽性細菌具有抗菌活性，尤其是表皮葡萄球菌。基于初步抗微生物篩選的結果，選擇了放線菌分離物063進行了顯微鏡檢查，并鑒定了其形态學、培養、生理和生化特性。
標明的分離物隻在ISP-3培養基上形成淡黃色的明确定義色素。標明的分離物在不同培養基上顯示出不同的基質菌絲和空氣菌絲顔色。除ISP-7外，所有測試的培養基上空氣菌絲的顔色都是灰色的，而基質菌絲的顔色從灰黃色到灰色且毛茸茸不等。在1000×放大倍數下，通過光學顯微鏡觀察到放線菌分離物063的螺旋鍊結構。在20000×放大倍數下，通過透射電子顯微鏡觀察到標明分離物的孢子表面形态是光滑的。
生理和生化特性，利用生理和生化特性對放線菌分離物進行了鑒定。該分離物在不同碳化合物上的生長程度從好到中等到弱。結果進一步表明，該分離物無法利用蔗糖作為唯一的碳源。此外，硝酸鹽還原試驗和明膠酶試驗為陽性，而凝乳試驗結果為陰性。
利比亞土壤中放線菌的廣譜抗微生物活性及其潛在應用探索
放線菌代表着一類多樣化的細菌，因其産生具有強效抗微生物活性的生物活性化合物而受到廣泛。然而，随着多耐微生物數量的增加，對新型強效抗微生物的需求變得越來越迫切。這些放線菌主要存在于土壤中，并且可能因土壤類型而異，是以在尋找有價值的抗微生物化合物時，探查廣泛的地區至關重要。
從未被探索或開發的生境中分離放線菌可能為發現新的有效化學物質和生物活性化合物提供有希望的途徑。利比亞有廣闊而大部分未被探索的地區，這些地區可能産生獨特的新型生物活性次生代謝産物。
是以，對利比亞的放線菌進行可能會尚未被為潛在代謝産物來源的抗微生物物質，适用于農業技術。通過探索這些未知和未開發的生境，可能會發現尚未或開發用于農業和工業應用的新物種的放線菌。
結果顯示，從利比亞77個不同地點采集的300個土壤标本中獲得了164個放線菌分離物。在164個放線菌分離物中，有38個分離物（23.17%）在形态上是不同的。篩選結果顯示，在這38個分離物中，有11個分離物（28.95%）對被測試的微生物表現出抗微生物活性。
這些分離物對表皮葡萄球菌（90.9%）、金黃色葡萄球菌和肺結核分枝杆菌（81.2%）、枯草杆菌和沙門氏菌（72.7%）、大腸杆菌（63.6%）和鍊球菌（18.2%）的抗菌活性較為有效，而（63.6%）的分離物對黑曲黴和白色念珠菌表現出活性。對大多數分離物來說，對鍊球菌的抗性較高可能是因為其産生了一種酶，使其能夠使抗菌物質失去活性。
與革蘭氏陰性細菌相比，更多的分離物對革蘭氏陽性細菌表現出活性。這可能是因為這些微生物細胞壁的形态差異。革蘭氏陰性細菌的外膜提供了難以透過的脂溶性化合物的壁壘。外膜的脂質和蛋白質組成在為難以透過的抗生素和其他化合物提供壁壘方面起着重要作用，而孔隙蛋白則起着對親水性溶質的選擇性滲透屏障作用。另一方面，革蘭氏陽性細菌隻有一個無法起到抗菌劑滲透屏障作用的肽聚糖層。
在所有分離物中，從瓦丹（一個沙漠地區）土壤中分離的菌株063表現出高度廣譜的抗微生物活性，抑制了本測試的所有微生物的生長。一個分離物可能産生多種代謝活性化合物。瓦丹土壤的化學結構含有高濃度的碳酸鈣（CaCO3）。經過碳酸鈣處理的土壤樣本對分離出具有抗微生物活性的活性放線菌最為有效。碳酸鈣是促進放線菌對原體抗微生物活性的最有效添加劑之一。瓦丹土壤可能是來自微生物的新型天然産物的重要來源。
孢子鍊形态和孢子表面的裝飾等參數對放線菌的分類和鑒定是基礎性的。顯微鏡檢查表明，這些分離物屬于鍊黴菌屬。Streptomyces屬在各種土壤類型的放線菌中的頻率和優勢性。根據空氣菌絲的顔色，標明的分離物與灰色系列密切相關。這些結果與之前獲得的結果一緻，表明灰色和白色系列的放線菌在土壤中是優勢類型。在顯微鏡下觀察到標明分離物的空氣菌絲的孢子鍊呈螺旋形。大多數分離物被認為是螺旋形和直性-柔性的孢子。
結論
再從利比亞土壤中分離放線菌，并評估其對多種抗微生物活性。結果顯示，所有分離物都屬于鍊黴菌屬。標明的來自極端地理和氣候區域（Aljufra地區的Wadan土壤）的分離物063表現出對所有測試微生物的有希望的抗微生物活性。
這可能與其含有多種生物活性化合物有關。總體而言，探索利比亞土壤以尋找新的放線菌是發現獨特抗微生物的有希望途徑。利用分子技術這些放線菌可能有助于更好地了解它們産生這些有價值物質的機制。
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