前言
细菌对多种抗生素产生快速耐性的问题已成为全球公共关注的焦点。从利比亚不同地区的土壤中分离并筛选了放线菌，以评估它们对细菌和真菌的抑制活性。共采集了300个土壤样本，来自77个不同的生态系统，包括沙漠、森林、牧场和农田，分布在利比亚不同气候地区。总共获得了164个放线菌分离物。其中38个（23.2％）分离物通过孢子链和表面形态学、空气和基质菌丝以及可溶性色素的形态学和显微镜学特征进行了初步鉴定。
初步分类结果显示，所有分离物属于链霉菌属。随后对这些分离物进行了抗菌潜能的测试，针对九种细菌和真菌。在38个分离物中，有11个（28.9％）分离物显示出对至少两种测试菌株产生抑制物质的能力。在细菌菌株中，金黄色葡萄球菌对这十一个分离物几乎全部敏感（90.9％），而链球菌对大多数选定的分离物表现出耐性（18.2％）。其中，来自沙漠地带Wadan土壤的分离物编号063是唯一一株对所有测试的原微生物都表现出广谱抗菌活性的分离物。
根据其培养、形态、生理和生化特性，将063号分离物鉴定为罗奇链霉菌。利比亚的土壤，尤其是在极端环境中，可能是具有抗微生物活性的生物活性物质的潜在来源。建议在利比亚未被开发和利用的未知地区探索新的栖息地，这可能为治疗应用提供有前景的生物活性化合物资源。
具备强效抗微生物活性的生物宝库
土壤是一种高度被开发的生态位，其居民产生各种生物活性天然化合物，包括对临床有意义的抗生素。大多数抗微生物是由放线菌和真菌的天然产物衍生而来。在这些属中，链霉菌在土壤中特别普遍。链霉菌属成员是革兰氏阳性、需氧的土壤居民，在自然界广泛分布，是大多数土壤中微生物群落的重要组成部分。
放线菌的最有益和重要特性之一是它们能够产生抗生素和其他次生代谢产物，这些化合物表现出各种生物活性，如抗菌、抗真菌、细胞毒性、细胞抑制、 抗氧化、色素和酶等。放线菌产生的物质具有多样的化学结构，包括大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类、糖肽类和茚环类物质。
尽管这些生物活性非常重要，但由放线菌产生的大量次生代谢产物因细菌的出现而失去了效力。迫切需要从尚未被开发用于农业和工业应用的新物种的放线菌中发现和开发独特的生物活性物质。此外，放线菌的生物活性可能会因土壤类型及其组成而异。
利比亚的土壤由于其广阔而大部分未被探索的地区，可能提供发现新放线菌的巨大潜力。因此，探索新的地区并开发创新技术以发现具有强效抗微生物活性的新放线菌已变得越来越迫切。从利比亚土壤中分离、检测和表征放线菌，作为生物活性代谢产物的关键来源。
土壤样本中利比亚放线菌的抗菌活性
共从利比亚各个气候地区的77个不同生态系统中随机采集了300个土壤样本，包括沙漠、森林、农田和牧场。在采集土壤时，考虑了人口密集和人口稀少的地区。土壤样本是在2006年12月至2007年7月的六个月期间获得的。在去除松散表面凋落物层后，从10厘米深度处获取土壤样本，将其放入无菌试管中，密封并在筛选之前储存在4℃下。
采用以下放线菌分离方法。使用的培养基为Shirling和Gottlieb推荐的培养基。放线菌是利用土壤稀释平板法和酵母提取物-麦芽提取物琼脂（ISP2）来纯化放线菌分离物斜面的。将1克干燥土壤放入9毫升蒸馏水中，搅拌15分钟，然后让悬浮液静置15分钟。含有10^-4 - 10^-6稀释土壤样品的试管放入45°C水浴中培养16小时，使孢子与营养细胞分离，然后将稀释液接种在放线菌分离琼脂平板的表面上。选定的放线菌菌落转移到琼脂平板上，在28°C下培养7 - 14天。
使用的测试微生物包括表皮葡萄球菌 (Staph. epidermidis) ATCC 12228、金黄色葡萄球菌 (Staph. aureus) ATCC 29737、枯草芽孢杆菌 (B. subtilis) ATCC 6633、链球菌 (Strep. pyogenes) DSM 2072、菲氏分枝杆菌 (Mycob. phlei) EMCC 1113、大肠杆菌 (E. coli) DSM 498、沙门氏菌 (Sal. enterica) ATCC 25566、白色念珠菌 (C. albicans) EMCC 105和黑曲霉 (A. niger) EMCC 132。这些微生物均来自埃及阿因谢姆斯大学农学院的MIRCEN Cairo。
通过琼脂扩散法，测试放线菌分离物对选定微生物的抗菌活性 。将放线菌分离物在酵母提取物-麦芽提取物琼脂（ISP2）上培养7 - 14天，在28°C下孵育。用直径为9毫米的琼脂圆片用无菌塞状器剪下，转移到先前接种了测试微生物的琼脂平板表面。对于表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌，使用营养琼脂培养基。
对于链球菌，使用大豆胰蛋白胨琼脂培养基。对于菲氏分枝杆菌，使用甘油土壤琼脂培养基。对于白色念珠菌，使用沙氏葡萄糖琼脂培养基。对于黑曲霉，使用土豆葡萄糖琼脂培养基。培养皿在30℃下孵育48小时，对于白色念珠菌和黑曲霉，对于其他测试微生物，如枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、链球菌、菲氏分枝杆菌和沙门氏菌，则在37℃下孵育24小时。
在每个平板上的菌落周围存在明显的透明环表示该菌落产生抗菌化合物的有效性。所有观察和数据都被记录下来。用于所有菌株形态学的标准培养基包括：酵母提取物-麦芽提取物琼脂（ISP-2）；燕麦粥琼脂（ISP-3）；无机盐-淀粉琼脂（ISP-4）；以及甘油-天冬氨酸琼脂（ISP-5），这些都是由Shirling和Gottlieb使用的。另外还使用了葡萄糖-天冬氨酸琼脂、赛贝克琼脂、酪蛋白胨琼脂（ISP-7）、营养琼脂和Bennett琼脂（葡萄糖-酪蛋白胨-酵母-牛肉琼脂），这些都是根据Higgens和Kastner的方法。
在28℃下培养7 - 14天后，记录了纯分离物在各种培养基上的培养特性。通过使用Shirling和Göttlieb的方法进行显微镜观察。使用不同琼脂培养基来确定空气菌丝、基质菌丝和可溶性色素的颜色。利用光学显微镜（美国纽约尼康公司）和透射电子显微镜（德国OberkochenZeiss EM-10）检查生长在9种不同培养基（包括ISP 2、3、4、5和7，Bennett琼脂、赛贝克琼脂、葡萄糖-天冬氨酸琼脂和营养琼脂）上的7天、14天和21天培养的微观形态学特征。
文化、形态学、生理学和生化学特征，将放线菌分离物鉴定到种属水平。还进行了链霉菌的数值分类以鉴定所选分离物。利用孢子链形态、空气和基质菌丝、可溶性色素、黑色素产生以及广泛碳源的利用等方面的相似性和差异性，得到了各组。根据Trenser和Backus 的描述，将培养物分配到不同的系列（灰色（GY）、红色（R）、黄色（Y）、蓝色（B）、绿色（GN）、紫色（V）和白色（W））。
放线菌的分离
从利比亚的77个不同地点采集了300个土壤标本，得到了164株放线菌的分离物。在这164个分离物中，有38个（23.17%）进行了形态学特征的表征。然后对这些分离物进行了对七种细菌和两种真菌菌株的抗微生物活性筛选。初步的抗微生物筛选显示，在这38个分离物中，编号为07、010、025a、025b、037、057、062、063、067、069和071的分离物对至少一种被测试的微生物原体表现出抗微生物活性。
来自瓦丹市（沙漠地区）的编号为063的分离物表现出广谱的抗微生物活性，对所有被测试微生物的抑制区直径在10到15毫米之间。所有分离物对链球菌性原体均未表现出抗微生物活性，除了编号为25a和063的分离物。这些分离物对几乎所有被测试的革兰氏阳性细菌具有抗菌活性，尤其是表皮葡萄球菌。基于初步抗微生物筛选的结果，选择了放线菌分离物063进行了显微镜检查，并鉴定了其形态学、培养、生理和生化特性。
选定的分离物只在ISP-3培养基上形成淡黄色的明确定义色素。选定的分离物在不同培养基上显示出不同的基质菌丝和空气菌丝颜色。除ISP-7外，所有测试的培养基上空气菌丝的颜色都是灰色的，而基质菌丝的颜色从灰黄色到灰色且毛茸茸不等。在1000×放大倍数下，通过光学显微镜观察到放线菌分离物063的螺旋链结构。在20000×放大倍数下，通过透射电子显微镜观察到选定分离物的孢子表面形态是光滑的。
生理和生化特性，利用生理和生化特性对放线菌分离物进行了鉴定。该分离物在不同碳化合物上的生长程度从好到中等到弱。结果进一步表明，该分离物无法利用蔗糖作为唯一的碳源。此外，硝酸盐还原试验和明胶酶试验为阳性，而凝乳试验结果为阴性。
利比亚土壤中放线菌的广谱抗微生物活性及其潜在应用探索
放线菌代表着一类多样化的细菌，因其产生具有强效抗微生物活性的生物活性化合物而受到广泛。然而，随着多耐微生物数量的增加，对新型强效抗微生物的需求变得越来越迫切。这些放线菌主要存在于土壤中，并且可能因土壤类型而异，因此在寻找有价值的抗微生物化合物时，探查广泛的地区至关重要。
从未被探索或开发的生境中分离放线菌可能为发现新的有效化学物质和生物活性化合物提供有希望的途径。利比亚有广阔而大部分未被探索的地区，这些地区可能产生独特的新型生物活性次生代谢产物。
因此，对利比亚的放线菌进行可能会尚未被为潜在代谢产物来源的抗微生物物质，适用于农业技术。通过探索这些未知和未开发的生境，可能会发现尚未或开发用于农业和工业应用的新物种的放线菌。
结果显示，从利比亚77个不同地点采集的300个土壤标本中获得了164个放线菌分离物。在164个放线菌分离物中，有38个分离物（23.17%）在形态上是不同的。筛选结果显示，在这38个分离物中，有11个分离物（28.95%）对被测试的微生物表现出抗微生物活性。
这些分离物对表皮葡萄球菌（90.9%）、金黄色葡萄球菌和肺结核分枝杆菌（81.2%）、枯草杆菌和沙门氏菌（72.7%）、大肠杆菌（63.6%）和链球菌（18.2%）的抗菌活性较为有效，而（63.6%）的分离物对黑曲霉和白色念珠菌表现出活性。对大多数分离物来说，对链球菌的抗性较高可能是因为其产生了一种酶，使其能够使抗菌物质失去活性。
与革兰氏阴性细菌相比，更多的分离物对革兰氏阳性细菌表现出活性。这可能是因为这些微生物细胞壁的形态差异。革兰氏阴性细菌的外膜提供了难以透过的脂溶性化合物的壁垒。外膜的脂质和蛋白质组成在为难以透过的抗生素和其他化合物提供壁垒方面起着重要作用，而孔隙蛋白则起着对亲水性溶质的选择性渗透屏障作用。另一方面，革兰氏阳性细菌只有一个无法起到抗菌剂渗透屏障作用的肽聚糖层。
在所有分离物中，从瓦丹（一个沙漠地区）土壤中分离的菌株063表现出高度广谱的抗微生物活性，抑制了本测试的所有微生物的生长。一个分离物可能产生多种代谢活性化合物。瓦丹土壤的化学结构含有高浓度的碳酸钙（CaCO3）。经过碳酸钙处理的土壤样本对分离出具有抗微生物活性的活性放线菌最为有效。碳酸钙是促进放线菌对原体抗微生物活性的最有效添加剂之一。瓦丹土壤可能是来自微生物的新型天然产物的重要来源。
孢子链形态和孢子表面的装饰等参数对放线菌的分类和鉴定是基础性的。显微镜检查表明，这些分离物属于链霉菌属。Streptomyces属在各种土壤类型的放线菌中的频率和优势性。根据空气菌丝的颜色，选定的分离物与灰色系列密切相关。这些结果与之前获得的结果一致，表明灰色和白色系列的放线菌在土壤中是优势类型。在显微镜下观察到选定分离物的空气菌丝的孢子链呈螺旋形。大多数分离物被认为是螺旋形和直性-柔性的孢子。
结论
再从利比亚土壤中分离放线菌，并评估其对多种抗微生物活性。结果显示，所有分离物都属于链霉菌属。选定的来自极端地理和气候区域（Aljufra地区的Wadan土壤）的分离物063表现出对所有测试微生物的有希望的抗微生物活性。
这可能与其含有多种生物活性化合物有关。总体而言，探索利比亚土壤以寻找新的放线菌是发现独特抗微生物的有希望途径。利用分子技术这些放线菌可能有助于更好地了解它们产生这些有价值物质的机制。
参考文献
[1] Butler, M.S. and Buss, A.D. (2006) Natural Products—The Future Scaffolds for Novel Antibiotics? Biochemical pharmacology, 71, 919-929.
[2] Kumar, N., Singh, R.K., Mishra, S.K., Singh, A.K. and Pachouri, U.C. (2010) Isolation and Screening of Soil Actinomycetes as Source of Antibiotics Active against Bacteria. International Journal of Microbiology Research, 2, 12-16.
[3] Watve, M.G., Tickoo, R., Jog, M.M. and Bhole, B.D. (2001) How Many Antibiotics Are Produced by the Genus Streptomyces? Archives of microbiology, 176, 386-390.
[4] Tangerina, M.M., Furtado, L.C., Leite, V.M., Bauermeister, A., Velasco-Alzate, K., Jimenez, P.C and Pena Ferreira, M.J. (2020) Metabolomic Study of Marine Streptomyces sp.: Secondary Metabolites and the Production of Potential Anticancer Compounds. PLOS ONE, 15, e0244385.
[5] de Lima Procópio, R.E., da Silva, I.R., Martins, M.K., de Azevedo, J.L. and de Araújo, J.M. (2012) Antibiotics Produced by Streptomyces. The Brazilian Journal of Infectious Diseases, 16, 466-471.