糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN/DKD）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）嚴重微血管并發症，是導緻DM患者緻殘、緻死的主要原因。DN起病隐匿，一旦進入臨床蛋白尿期，腎功能迅速下降，其發展至終末期腎髒病的速度約是其他腎病的14倍，故早期診斷加以有效防治是逆轉病情惡化的關鍵[1]。現階段DN的防治以控制血壓、降血糖、糾正血脂紊亂等綜合治療為主，但上述措施仍不能完全阻止DN的進展，長期服用化學藥會引起一系列不良反應，療效尚不理想[2]。是以，深入探索DN發病機制、尋找診斷标志物、制定有效治療方案是目前亟待解決的重點問題。
長鍊非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長度大于200個核苷酸且不具備編碼蛋白質功能的RNA，曾被認為是“轉錄噪音”[3]。近年來，研究發現lncRNA可通過介導染色質重塑、DNA甲基化、組蛋白修飾等多種機制，參與基因的表觀遺傳、轉錄及轉錄後水準調控，并具有細胞特異性、組織特異性，在疾病中發揮重要作用[4-5]。
現有研究報道lncRNA可通過分子海綿機制與微RNA（microRNA，miRNA）結合形成競争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）網絡，進而引發DN系膜細胞增殖、腎組織纖維化、發炎反應的發生[6-8]。中醫藥可減輕蛋白尿、延緩腎衰竭，常被用作DN主要或輔助治療以及新藥開的來源，且具有療效穩定、安全性高等獨特優勢。是以，本研究借助生物資訊學初步建構DN潛在ceRNA調控網絡，從分子水準角度預測有效治療中藥，以期為DN預防、診斷以及新藥研發提供新思路。
1 材料與方法
1.1 基因晶片的篩選
在GEO資料庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo/）中以“diabetic kidney disease”“DKD”“diabetic nephropathy”“DN”為檢索詞，設定研究物種為“Homosapiens”，研究類型為“expression profiling by array”檢索DN基因晶片，下載下傳基因矩陣檔案與平台注釋檔案。
1.2 差異表達lncRNA（DElncRNA）與差異表達信使RNA（DEmRNA）的擷取
根據平台注釋檔案提供資訊将探針轉換成對應的基因ID，利用perl對基因重注釋，區分出lncRNA和mRNA，采用R語言結合limma包對基因晶片進行校正、标準化、log2轉化處理以及差異性分析，設定差異篩選條件為|log2FC|＞0.5，調整P值＜0.05，篩選出DElncRNA與DEmRNA，通過GraphPad Prism 9與TBtools軟體分别繪制火山圖及熱圖。
1.3 ceRNA網絡建構
通過miRcode（http://www.mircode.org/）、miRDB（http://mirdb.org）、miRTarBase（http://mirtarbase. mbc.nctu.edu.tw/）、TargetScan（http://www.targetscan. org/vert_80/）資料庫整合“DElncRNA-miRAN”和“miRNA-DEmRNA”的關系，删除不存在靶向調控關系的lncRNA、miRNA、mRNA，導入Cytoscape 3.7.2軟體建構DN潛在“lncRNA-miRNA-mRNA”的ceRNA調控網絡并進行可視化展示。
1.4 蛋白-蛋白互相作用（PPI）網絡分析與關鍵基因的篩選
将ceRNA網絡中DEmRNA導入String資料庫（https://cn.string-db.org/），設定研究物種為“Homosapiens”，最低互相作用門檻值為“medium confidence（0.400）”，隐藏遊離基因建構PPI網絡，借助Cytoscape 3.7.2中插件計算PPI網絡中每個節點的度值（degree），節點在PPI網絡中與其他基因關聯性強弱與度值呈正比，根據度值選取排名前15的節點定義為關鍵基因。
1.5 基因本體論（GO）功能注釋和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析
Metascape（https://metascape.org/）資料庫整合Drugbank、GO、KEGG等多個權威的資料庫，擁有強大基因注釋功能，操作簡單，具有時效性和可靠性，是以本研究通過Metascape資料庫對ceRNA網絡進行GO及KEGG富集分析，将DEmRNA導入Metascape資料庫，選擇物種為“Homosapiens”，設定“Min Overlap:3”“P Value Cutoff:0.01”“Min Enrichment:1.5”，根據−lgP值對結果進行排序，展示排名靠前的生物過程以及KEGG信号通路。
1.6 中藥預測結果與“中藥-活性成分-靶基因”網絡建構
借助Coremine Medical（https://www.pubgene. com/coremine-medical/）資料庫查詢關鍵基因相關資訊，設定P＜0.05，擷取與關鍵基因具有統計學意義的中藥。利用TCMSP（https://www.tcmsp-e.com/）、PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、UniProt（https://www.uniprot.org/）、SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）資料庫并結合文獻收集整理預測中藥的活性成分及對應靶點，将靶點轉換為标準的基因名稱，通過Cytoscape 3.7.2建構“中藥-活性成分-靶基因”網絡。
1.7 分子對接驗證
利用Cytoscape 3.7.2中“Network Analyze”插件對“中藥-活性成分-靶基因”進行分析，選取度值排名前5的活性成分與排名前5的關鍵基因進行分子對接。在PubChem資料庫擷取活性成分結構，通過Open Babel軟體将其轉存為mol2格式，在PDB（https://www.pdbus.org/）資料庫中下載下傳關鍵基因3D結構，通過PyMOL軟體除去其的水分子與配體。利用AutoDockTools-1.5.6軟體對關鍵基因和活性成分加氫、計算電荷等處理并儲存為pdbt格式。通過AutoDock vina對關鍵基因和活性成分進行分子對接并計算結合能，選取結合能最低的前5組構象進行可視化展示。
2 結果
2.1 基因晶片擷取
經篩選，将編号為GSE30529的晶片矩陣檔案和編号為GPL571的平台注釋檔案納入本研究，此晶片中共有22個樣本，其中包含12個健康人（對照）的腎髒樣本，10個來自于DN患者提供的腎髒樣本（表1）。
2.2 DElncRNA與DEmRNA篩選情況
利用perl腳本對基因重注釋，以|log2FC|＞0.5，調整P值＜0.05差異基因篩選條件，最終獲得12個DElncRNA，其中包括上調1個，下調11個；1300個DEmRNA，其中包括上調651個，下調649個，借助GraphPad Prism 9繪制lncRNA和mRNA火山圖（圖1、2），藍色代表達下調表基因，紅色代表表達上調基因，借助TBtool軟體繪制lncRNA熱圖（圖3），選取上調和下調最顯著前20個的DEmRNA繪制mRNA熱圖（圖4）。
2.3 ceRNA網絡建構
通過miRcode資料庫預測共獲得190個與lncRNA互相作用的miRNA；将190個miRNA映射到miRDB、miRTarBase和TargetScan資料庫中共獲得1249個mRNA，将預測獲得mRNA與“2.2”項中1300個DEmRNA取交集，删除不存在靶向調控關系的lncRNA、miRNA，整合lncRNA-miRNA、miRNA-mRNA的調控網絡，最終獲得由9個lncRNA、33個miRNA、106個mRNA、270條邊所構成的ceRNA網絡（圖5）。
2.4 PPI網絡建構及關鍵基因篩選
将“2.3”項中獲得106個mRNA導入STRING線上平台工具，選擇物種為“Homosapiens”，設定最低互相作用門檻值為“medium confidence（0.400）”，隐藏遊離蛋白，儲存tsv格式，借助Cytoscape 3.7.2軟體建構PPI網絡（圖6），并計算出每個節點度值，将度值将排名前15的基因定義為關鍵基因（圖7）。
2.5 GO功能注釋與KEGG通路富集分析結果
Metascape平台對106個mRNA進行GO及KEGG富集分析。GO富集分析結果顯示，106個mRNA主要涉及血小闆衍生生長因子受體信号通路（platelet-derived growth factor receptor signaling pathway）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）級聯（MAPK cascade）、對雌二醇的反應（response to estradiol）、皮質類固醇受體信号通路（corticosteroid receptor signaling pathway）等生物過程（圖8）；
KEGG通路富集分析結果顯示，106個mRNA主要涉及磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、調節幹細胞多能性的信号通路（signaling pathways regulating pluripotency of stem cells）、乙型肝炎（hepatitis B）、膀胱癌（bladder cancer）、p53信号通路（p53 signaling pathway）、血管内皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路（VEGF signaling pathway）等通路（圖9）。
2.6 中藥預測與“中藥-活性成分-靶基因”網絡建構
将關鍵基因映射到Coremine Medical資料庫，設定P＜0.05，擷取治療DN潛在有效中藥，結果顯示雷公藤、藤黃、黃芪、三七、黃芩、白花丹等多味中藥與DN密切相關（表2）。選取頻次前4味中藥建構“中藥-活性成分-靶基因”網絡圖。設定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%，類藥性（drug-likeness，DL）＞0.18，在TCMSP資料庫收集雷公藤、黃芪、三七活性成分與靶點，通過UniProt将靶點進行規範化命名，TCMSP資料庫尚未收入藤黃，是以查閱文獻整理藤黃成分，通過PubChem、SwissTargetPrediction資料庫擷取對應成分靶基因，采用Cytoscape 3.7.2将“中藥-活性成分-靶基因”進行可視化展示（圖10）。
2.7 分子對接結果
對“中藥-活性成分-靶基因”進行“Network Analyze”分析，排名前5位的活性成分為槲皮素（quercetin）、藤黃酸（morellic acid）、異藤黃酸（isomorellic acid）、山柰酚（kaempferol）、gambogellic acid，分别與排名前5的關鍵基因MYC（一類核蛋白類癌基因）、VEGFA、zeste同系物增強劑2（EZH2）、第10号染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）、MAPK1進行分子對接并計算結合能（表3），配體與蛋白之間親和力越強，結合能越低，當結合能＜−4.25 kcal/mol（1 kcal＝4.2 kJ），表示配體與蛋白受體具有結合活性；結合能＜−5.0 kcal/mol，表示二者具有良好的親和力，結合能＜−7.0 kcal/mol，表示二者具有強烈的親和力
本研究分子對接結果顯示結合能均＜−7.0 kcal/mol，說明活性成分與關鍵基因具有強烈對接活性，進一步提示中藥預測結果的可靠性，運用PyMoL軟體将結合能最低的前5組對接結果可視化，并展示結合殘基名稱和連接配接氫鍵及距離（圖11）。
3 讨論
ceRNA網絡是一種全新且更加精準的基因調控模式，該學說認為lncRNA可通過競争性吸附miRNA的反應元件來抑制miRNA對mRNA的靶向調控[9]。ceRNA網絡的提出颠覆“蛋白質編碼基因隻有翻譯成蛋白質才能發揮作用”這一傳統觀念，縮小研究範圍，提高靶點預測結果的準确性，可為疾病篩選潛在的診斷标志物與治療靶基因[10]。中醫藥多成分、多靶點、多途徑等特點，在DN的治療上具有廣泛前景，是以，基于ceRNA網絡角度挖掘DN潛在的有效中藥也将為DN診治提供新的方向。
本研究采用生物資訊學技術篩選，最終獲得由9個lncRNA、33個miRNA、106個mRNA所組成的ceRNA網絡。在DN細胞模型中lncRNA HLA複合體P5（HLA complex P5，HCP5）通過介導miR-93-5p/高遷移率族蛋白A2（highmobility group A2，HMGA2）軸，激活Akt-哺乳動物雷帕黴素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号，誘導腎小球系膜細胞過度增殖、腎組織纖維化和發炎反應的發生[11]。氧化反應是高血糖介導的腎功能損傷的緻病基礎，參與DN病程中多個環節[12]。
Zhao等[13]發現miR-142-3p過表達可減輕高糖狀态下腎小管上皮細胞的凋亡和氧化應激反應，進而延緩疾病進展。Hong等[14]發現在DN患者血漿中，miR-193a-3p表達上調，與尿蛋白水準呈正相關，與腎小球濾過率水準呈負相關，且miR-193a-3p高表達的患者非透析生存期顯著縮短，是以認為miR-193a-3p有望成為DN新型診斷标志物。此外，以miR-23b-3p[15]、miR-17-5p[16]、miR-206[17]為中心構成ceRNA網絡調控DN的發生與發展也均都得到證明。研究發現，PTEN蛋白丢失，可加劇DN腎髒纖維化程度、破壞足細胞導緻蛋白尿的形成[18-19]。腎小管上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是引起腎小管間質纖維化的中心環節[20]。高糖狀态下，EZH2過表達可導緻上皮鈣黏蛋白丢失、α平滑肌肌動蛋白以及腎間質中的膠原蛋白異常沉積，進而促進EMT程序[21]。
GO富集結果顯示，ceRNA調控網絡主要通過血小闆衍生生長因子受體信号通路、MAPK級聯、對雌二醇的反應等過程參與DN的發生與發展。研究發現，血小闆衍生生長因子受體-β基因的缺失可顯著降低DN小鼠的尿白蛋白/肌酐值，并減少8-羟基脫氧鳥苷（8-hydroxy-deoxyguanosine，8-OHdG）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase4，NOX4）、谷胱甘肽過氧化物酶1（glutathione peroxidase1，GPX1）、錳超氧化物歧化酶（manganese-superoxide dismutase，Mn-SOD）的表達，抑制氧化應激反應和腎小球系膜擴張[22]。
MAPK級聯途徑中的氨基末端激酶（jun kinase，JNK）、細胞外信号調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p38 MAPK等信号通路均與DN存在緊密聯系，其中p38 MAPK的研究最為廣泛。p38 MAPK信号可激活下遊發炎細胞，加快發炎媒體和細胞因子的釋放，而發炎因子又可反向激活p38 MAPK信号，陷入惡性循環，加重DN腎組織炎性損傷[23]。此外，p38 MAPK信号活化又可觸發腎組織纖維化和氧化應激的發生[24-25]。雌二醇對女性DN患者具有保護作用，其可抑制膠原蛋白合成，刺激基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的合成，減輕腎小管間質纖維化以及腎小球硬化，同時還可降低血管緊張素Ⅱ和内皮素的合成，促進NO的釋放，抑制腎髒血管的收縮，改善NO和發炎對腎髒的損傷[26]。
KEGG富集分析顯示ceRNA調控網絡主要通過PI3K-Akt、p53、VEGF等信号通路參與DN的發生與發展。PI3K-Akt信号通路是參與細胞增殖、生長和存活的重要通路[27]。PI3K作為通路的起始因子，首先通過磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidy-linositol diphosphate，PIP2）磷酸化作用生成PIP3，進而激活Akt，Akt活化後可靶向調控其下遊分子mTOR、叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，FoxO1）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT-4）等的表達，進而介導機體自噬、凋亡、發炎、糖脂代謝反應，推動DN的進展[28]。
p53是重要的核轉錄因子，在誘導細胞周期停滞或凋亡等損傷性反應中起着核心作用。現有研究證明p53信号通路介導高糖誘導足細胞凋亡與自噬反應[29-30]。在腎髒中，VEGF主要由足細胞分泌，VEGF表達失衡可增強血管通透性和腎小球濾過率，促進蛋白尿産生[31]。姚向飛等[32]發現VEGF随着DN病情的進展而不斷升高，與尿微量蛋白水準呈正相關。但另有研究發現當疾病進入大量蛋白尿期，VEGF表達卻有所下降，推測其原因可能是由于腎功能嚴重損傷，足細胞大量丢失，導緻VEGF合成量減少所緻，提示監測VEGF的水準變化對評估DN腎髒損傷程度具有重要意義[33]。
祖國醫學雖無DN這一病名，但對其相關描述卻早有記載，如《聖濟總錄》曰：“消渴病久，腎氣受傷，腎主水，腎氣虛衰，氣化失常，開阖不利，能為水腫”。根據臨床症狀将其歸屬為“消渴腎病”“腎消”“下消”等範疇。DN病機複雜，證候多樣性，醫家對其見解各有不同。但普遍認為DN為素體腎虛，加之消渴遷延日久，耗氣傷陰，以緻五髒虛損；虛則氣血津液運作無力，痰濕瘀血内停，聚而不散，日久郁而化熱成毒，最終導緻虛、痰、熱、瘀、毒等病理因素互相膠結而緻病，“本虛标實”“虛實夾雜”為本病病機特點[34]。臨床上治療以補脾益腎、清熱解毒、活血化瘀為主。
預測所獲得的核心中藥雷公藤、藤黃、黃芪、三七、黃芩等屬于上述治療範疇，現代藥理學研究表明，這些藥物均具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用[35-39]。Wu等[40]發現雷公藤的有效成分雷公藤多苷可通過抑制腎小球巨噬細胞浸潤和發炎因子表達，并下調p38 MAPK、NF-κB通路活性，減少轉化生長因子-β1（TGF-β1）生成，進而改善腎組織炎性損傷以及腎小球硬化。
黃芪主要活性成分黃芪甲苷及黃芪多糖通過多方面對DN起到治療作用，首先可抑制内質網應激發生的關鍵分子如轉錄激活因子6（ATF6）、蛋白激酶R樣内質網激酶（PERK）、肌醇依賴酶1α（IRE1α）等的活化，維持内質網功能穩态，延緩DN進展；其次，可抑制TGF-β1/Smad（small mothers against decapentaplegic）通路，調控MMP家族基因的表達，減輕系膜細胞的增殖以及細胞外基質異常堆積，改善腎組織纖維化；再次，可通過活化核因子E2相關因子2（Nrf2）/抗氧化反應元件（ARE）通路，抑制NF-κB、惡性良性腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等表達，減輕腎髒組織凋亡與發炎反應；最後，可促進過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）及CCAAT/增強子結合蛋白α（C/EBPα）的表達，增強胰島素敏感性，調節糖脂代謝紊亂[41]。
董蘇敏等[42]發現三七總皂苷可通過激活Nrf2/血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）信号通路抑制發炎與氧化應激反應，對損傷的腎組織起到保護作用。吳軍等[43]發現黃芩苷可下調miR-141而促進沉默資訊調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）表達，進而緩解高糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡。預測結果顯示藤黃與DN存在緊密聯系，但目前尚未見相關報道，是以，有待後續進一步研究。
綜上，本研究通過初步建構DN潛在ceRNA網絡，豐富了DN發病機制研究内容，使後續的基礎與臨床研究更有針對性。此外，本研究将現代技術與傳統中醫藥相結合，以期從基因水準的角度挖掘中藥的潛在功效。
利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突
參考文獻（略）
來 源：安 琪，楊宇峰，石 岩．糖尿病腎髒病競争性内源RNA網絡建構及潛在中藥預測研究 [J]. 中草藥, 2023, 54(2):620-630.