三位科学家获奖
2017年10月4日，英国夏令时11：45（英国夏令时17：45），瑞典皇家科学院秘书长Göran K. Hansson宣布，2017年诺贝尔化学奖将授予瑞士洛桑大学的Jacques Dubochet，美国哥伦比亚大学的Joachim Frank和英国剑桥大学的Richard Henderson亨德森，以表彰他们对冷冻电显微镜发展的贡献。用于确定溶液中生物分子的高分辨率结构。三位获奖者将获得900万瑞典克朗（100万美元）的奖金。
获奖者介绍
雅克·杜博切特于1942年6月8日出生于瑞士艾格勒。获奖作品单位：瑞士洛桑大学。
诺贝尔奖获得者：雅克·杜博斯
雅克·杜博什出生于瑞士艾格峰。他曾在洛桑大学学习物理学，后来在日内瓦大学学习分子生物学。1973年，他在日内瓦大学和巴塞尔大学完成了生物物理学博士学位论文。从1978年到1987年，他在海德堡的欧洲分子生物学实验室工作，然后回到洛桑大学工作。
在20世纪80年代初，雅克·杜博奇（Jacques Duboche）成功地迅速冷却水，以获得玻璃状固体，而不是通常的结晶冰。这使得生物样品能够成功地应用于电子显微镜的观察。
约阿希姆·弗兰克于1940年9月12日出生于德国萨根。获奖工作单位：美国哥伦比亚大学。
诺贝尔奖获得者：阿西姆·弗兰克
阿西姆·弗兰克出生于德国北莱茵-威斯特法伦州的锡根。在弗莱堡大学和慕尼黑大学学习后，他于1970年获得慕尼黑工业大学的博士学位。弗兰克曾在美国和欧洲的多家机构工作，包括沃兹沃思中心，纽约州卫生部，纽约州立大学奥尔巴尼分校，霍华德休斯医学研究所和哥伦比亚大学，自2008年以来一直在哥伦比亚大学工作。阿西姆·弗兰克已婚，有两个孩子。
在1975年至1986年间，约阿希姆·弗兰克开发了一种分析和合并模糊二维电子显微镜图像的方法，以获得清晰的三维图像。这使得电子显微镜能够观察到更多的生物分子。
理查德·亨德森于1945年7月19日出生于苏格兰爱丁堡。他于1966年获得爱丁堡大学物理学学士学位，并于1969年获得剑桥大学博士学位。获奖工作单位：MRC分子生物学实验室，英国剑桥。
诺贝尔奖获得者：理查德·亨德森
理查德·亨德森出生于苏格兰爱丁堡。在爱丁堡大学学习后，他于1969年在剑桥大学MRC分子生物学实验室获得博士学位。在美国耶鲁大学工作一段时间后，他于1973年回到MRC分子生物学实验室，此后一直在那里工作。
理查德·亨德森（Richard Henderson）使用二维晶体成功地将细菌红斑等生物分子的分辨率推向原子分辨率。
研究工作介绍
从光学显微镜到电子显微镜的< >
人们对世界上的一切事物都充满了好奇心，俗话说，图像信息是我们理解一切的关键。但在古代，人们对事物的观察只能通过肉眼来实现，而人眼的辨别能力只有0.1毫米左右，因此对许多事物的理解并不全面。大约一千年前，人们偶然发现透明晶体或宝石被研磨成可以放大图像的"透镜"，这是人眼观察能力的第一次增强。
胡克使用的显微镜及其绘制的木材消火栓单元的示意图
到1590年，荷兰人詹森发明了世界上第一台显微镜。1665年，英国科学家Hulk（R. Hooke）使用显微镜观察了植物的木栓组织，发现它由许多规则的小方块组成，他绘制了观察到的图像并将其称为细胞或英语细胞。后来荷兰人Levin Hooker（A. Van Leeuwenhock本人）学会了研磨镜片，制作显微镜，观察微小植物和动物的结构，为生物学的发展做出了重大贡献。从那时起，在显微镜的帮助下，生物学有了显着的发展，可以观察到更小的结构。
光学显微镜
但是这种显微镜，先是用光照在被观察的物体上，然后经过反射光的处理，得到放大的图像，所以我们一般都叫光学显微镜。但光学显微镜的放大能力有限，如今的光学显微镜只能放大2000倍。显微镜的分辨率大约是可见光波长的一半，可见光的波长范围是300到700纳米，所以光学显微镜的理论最小分辨率是0.172微米，面对较小的结构无能为力。
显微镜的放大原理
随着科学技术的发展，光学显微镜不能满足科学研究的需要。20世纪以后，量子力学取得了显著的进步，人们对微观粒子的理解也更近了一步。电子具有波粒二分法的特点，并具有干涉和衍射等波动现象。通过加速电子，加速度电压为50~100kV，此时电子的波长为0.0053~0.0037纳米，远小于可见光的波长。如果电子可以用作显微镜的介质，则可以大大提高分辨率并观察到更精细的结构。
1931年，德国人Knoller和Ruska使用冷阴极放电电子源和三个电子透镜来修改高压示波器，获得了放大数十倍的图像，证明了电子显微镜放大成像的可能性。Ruska改造后，电子显微镜的分辨率提高到50纳米，大约是当时光学显微镜分辨率的十倍，电子显微镜开始受到关注。电子显微镜使人们能够看到病毒和大分子，而它们后面发明的扫描隧道显微镜使人们可以看到原子的结构。
电子显微镜的组成由三部分组成：桶，真空系统和动力柜。该筒包括电子光源、电子镜头、样品架、荧光屏和检测器。电子镜头是最重要的组件。光学显微镜中的凸透镜使光束聚集，而电子透镜使电子束聚集。现代电子显微镜主要使用电磁透镜，允许电子通过强磁场聚集。
光学显微镜和电子显微镜原理的比较
投影电子显微镜的成像原理与光学显微镜基本相同，只是它使用电子束作为光源，电磁场作为透镜。由于电子束非常不透水，因此电子镜中使用的标本必须制成约50纳米厚的超薄切片。透射镜是一种三维角散射，通过将加速和聚集的光束投射到非常薄的样品上，其中电子与样品中的原子碰撞并改变方向。散射角的大小与样品的密度和厚度有关，因此可以形成不同的图像，这些图像被放大并聚焦在成像设备上，例如荧光屏幕，胶片和光敏耦合组件。
现代电子显微镜
生物材料观察> < II
电子显微镜需要高速电子来轰击物质的表面，因此它们通常适用于"无生命"样品。对于生物材料来说，它是易碎的，不能承受电子的轰击，因此新发明的电子显微镜不能用于生物学研究。
1934年，Ladislaus Laszlo Marton使用电子显微镜检查生物标本，并写了两种可能的解决方案：使用负染色或在低温下冷却生物材料。
20世纪40年代出现后，负染色逐渐得到改进，当时重金属盐离子形成无定形薄膜，然后嵌入生物分子中。重金属盐离子和生物分子具有不同的散射电子的能力，如图像中所反映的那样，其中白色生物分子样品散射在黑色背景上。然而，该方法的分辨率受到重金属盐粒径的限制。然而，在那些日子里，使用负染色可以看到在普通光学显微镜下看不到的结构，因此它们在一些生物分子的三维结构和三维重建技术中仍然发挥着重要作用。现在阴性染色法在样品预筛选和初始模型构建等方面仍得到广泛应用。
但阴性染色只能观察到细胞器大小的结构，这些结构对于较小的单分子或分子复合物无能为力。
Marton的第二个想法是将生物样品保持在低温下，以便它们能够承受更多的电子轰击，并且解决了真空中生物样品的脱水和变形问题。但水在低温下形成结晶冰，导致电子强烈衍射，导致探测器收集几乎所有的结晶冰信号，从而模糊生物分子的信号。水晶冰也会影响蛋白质的天然结构。大多数生物分子仅在水溶液中保持其自然的空间结构。因此，为了使生物样品在低温下保持自然，必须解决结晶冰的问题。
从理论上讲，结晶冰形成的问题可以通过将液态水快速冷却成玻璃（非结晶状态）来克服。但20世纪80年代的理论预测表明，从大量的水相变中形成玻璃状冰所需的冷却速度很难实现。Myer在1980年的研究证实，在微米级具有快速冷冻尺寸的微滴可以转化为玻璃冰。
在20世纪80年代，Jacques Duboche设计了一种可行的解决方案，将薄膜冷冻成玻璃薄膜。将含有样品的溶液滴入处理过的铜网中，通过该层形成一层从纳米到微米级的薄水膜，然后在-180°C温度（液态乙烷或丙烷）下快速浸入，此时铜网络上的薄水膜迅速冻结成薄冰膜， 而生物样品也固定在薄冰膜中。Dubose使用该系统制备许多不同种类生物分子的冷冻样品，例如噬菌体，DNA，病毒，核糖体和其他冷冻样品。结果表明，这种方法是可行且重复的。
雅克·杜博斯制备冷冻生物样品的方法
<三>提高生物样品的分辨率
DuBose的原型方法将电镜生物学带入了冷藏电镜时代，为高分辨率结构的分析奠定了基础。1990年，理查德·亨德森（Richard Henderson）和其他人成功地将细菌类视黄醇的分辨率提高到原子分辨率，使用基于冷冻样品的方法的二维晶体。
亨德森首先使用X射线技术来分析生物分子的结构，但这种方法需要生物分子的结晶状态，这些生物分子极难结晶。在几次失败之后，亨德森转向了电子显微镜技术，该技术不需要生物分子结晶来解析其结构。
第一次观测到的视觉红质
细菌类视黄醇是一种特殊的蛋白质，它在一定条件下会形成整齐的紫色膜层，而紫色膜是二维晶体，因为蛋白质排列在单个平面上，不会在第三个方向上堆叠成三维。Henderson等人采取了一种不同的方法，将紫色薄膜直接制成样品。这是尚未冷冻的样品的概念，亨德森制作了一个温度样品，其中他添加了0.5%的葡萄糖溶液，以防止样品在真空中变干。
典型的生物样品只能用较低的电子剂量进行测试，从而导致成像质量降低。二维晶体可以衍射电子，通过软件处理提高成像质量。通过旋转样品，我们可以从不同角度获得样品的数据，并且可以通过晶体分辨率构建类视黄醇红质的三维结构，化学晶体分析技术非常成熟。
通过上述方法，Henderson分析了膜结构到0.7nm的分辨率，并首次看到了膜蛋白的转膜螺旋结构。后来，在制冷电镜技术发展之后，亨德森也进行了大量的研究，并在1990年将类视黄醇的分辨率进一步提高到0.35nm。
1990年观察到的视力发红
亨德森的工作不仅是第一个将膜蛋白解析为原子级分辨率的工作，而且还通过制冷电镜提高了对原子能级分辨率结构的信心。随后，还分析了膜蛋白的高分辨率结构，如光捕获复合物，αβ二聚蛋白和水通道蛋白。
<星期四>查看更多生物分子
然而，并非所有的生物分子都可以形成二维晶体，更多的生物分子只能以单个分子的形式存在于溶液中。单分子三维结构的电镜分析只能通过单粒子冷藏电子镜的三维重建来完成。
在20世纪70年代，约阿希姆·弗兰克（Joachim Frank）和其他人首次研究了低电子剂量下的图像质量增强。Frank通过结合后叠加法提高图像质量（增强的信噪比）来获得谷氨酰胺合成酶的二维投影平均值。但是，生物分子在不同角度的二维投影是不同的，即使在同一方向上投影，不同构象产生的二维投影也是不同的。生物分子不同角度的投影需要单独分类。通过查找投影特征点或特征区域，可以通过比较特征点或特征区域对它们进行分类。但是，在低质量的图片中寻找标志或特征区域也是一个挑战。Frank和van Heel使用一种称为多维数据分析的方法解决了。
分别为2011年（上图）和2016年（下图）相同生物分子的电镜图
从二维投影重建三维结构需要确定三维结构中每个二维投影的相对位置。1986年，Frank和Radermacher等人创造了一种称为随机圆锥旋转的方法，以确定二维投影在三维结构中的相对位置。
弗兰克在理论上为电镜生物学的发展做出了巨大贡献，他还开发了电镜处理软件SPIDER。
直接电子检测技术（DED）发明于21世纪初，不需要将电子信号转换为光信号，而是直接检测电子信号，减少了转换过程中引入的噪声量。2012年，将DED引入制冷镜中，采用单颗粒制冷电镜法，将转膜蛋白TRPV1的结构分析至0.38nm。今天的单颗粒冷冻电子，334kDa的蛋白质结构分辨率为0.18nm，64kDa的蛋白质结构分辨率为0.32nm。
电镜的发展
综上所述，人们对生物体的理解是：生命-组织-细胞-细胞-器官-生物分子。自然界中的大多数生物都可以用肉眼观察，身体的组织器官通过解剖学来理解，光学显微镜允许观察细胞结构，电子显微镜允许进一步观察器官的结构，直到制冷电子的发展，现在可以观察到许多生物分子的结构。
总结三者的贡献，杜博舍发明了采样方法，使电镜生物学进入制冷电镜时代，为分析高分辨率结构奠定了基础。亨德森的工作不仅是第一个将膜蛋白解析为原子级分辨率的工作，而且还通过制冷电镜提高了对原子能级分辨率结构的信心。弗兰克在理论上为电镜生物学的发展做出了巨大贡献，他还开发了电镜处理软件SPIDER。
资源
[1] https://www.nobelprize.org
李志飞， 高宁.制冷电镜技术应用于生物分子高分辨率结构分析—— 2017年诺贝尔化学奖， 大学化学， 2018， 33 （01）： 1-6.