三位科學家獲獎
2017年10月4日，英國夏令時11：45（英國夏令時17：45），瑞典皇家科學院秘書長Göran K. Hansson宣布，2017年諾貝爾化學獎将授予瑞士洛桑大學的Jacques Dubochet，美國哥倫比亞大學的Joachim Frank和英國劍橋大學的Richard Henderson亨德森，以表彰他們對冷凍電顯微鏡發展的貢獻。用于确定溶液中生物分子的高分辨率結構。三位獲獎者将獲得900萬瑞典克朗（100萬美元）的獎金。
獲獎者介紹
雅克·杜博切特于1942年6月8日出生于瑞士艾格勒。獲獎作品機關：瑞士洛桑大學。
諾貝爾獎獲得者：雅克·杜博斯
雅克·杜博什出生于瑞士艾格峰。他曾在洛桑大學學習實體學，後來在日内瓦大學學習分子生物學。1973年，他在日内瓦大學和巴塞爾大學完成了生物實體學博士學位論文。從1978年到1987年，他在海德堡的歐洲分子生物學實驗室工作，然後回到洛桑大學工作。
在20世紀80年代初，雅克·杜博奇（Jacques Duboche）成功地迅速冷卻水，以獲得玻璃狀固體，而不是通常的結晶冰。這使得生物樣品能夠成功地應用于電子顯微鏡的觀察。
約阿希姆·弗蘭克于1940年9月12日出生于德國薩根。獲獎工作機關：美國哥倫比亞大學。
諾貝爾獎獲得者：阿西姆·弗蘭克
阿西姆·弗蘭克出生于德國北萊茵-威斯特法倫州的錫根。在弗萊堡大學和慕尼黑大學學習後，他于1970年獲得慕尼黑工業大學的博士學位。弗蘭克曾在美國和歐洲的多家機構工作，包括沃茲沃思中心，紐約州衛生部，紐約州立大學奧爾巴尼分校，霍華德休斯醫學研究所和哥倫比亞大學，自2008年以來一直在哥倫比亞大學工作。阿西姆·弗蘭克已婚，有兩個孩子。
在1975年至1986年間，約阿希姆·弗蘭克開發了一種分析和合并模糊二維電子顯微鏡圖像的方法，以獲得清晰的三維圖像。這使得電子顯微鏡能夠觀察到更多的生物分子。
理查德·亨德森于1945年7月19日出生于蘇格蘭愛丁堡。他于1966年獲得愛丁堡大學實體學學士學位，并于1969年獲得劍橋大學博士學位。獲獎工作機關：MRC分子生物學實驗室，英國劍橋。
諾貝爾獎獲得者：理查德·亨德森
理查德·亨德森出生于蘇格蘭愛丁堡。在愛丁堡大學學習後，他于1969年在劍橋大學MRC分子生物學實驗室獲得博士學位。在美國耶魯大學工作一段時間後，他于1973年回到MRC分子生物學實驗室，此後一直在那裡工作。
理查德·亨德森（Richard Henderson）使用二維晶體成功地将細菌紅斑等生物分子的分辨率推向原子分辨率。
研究工作介紹
從光學顯微鏡到電子顯微鏡的< >
人們對世界上的一切事物都充滿了好奇心，俗話說，圖像資訊是我們了解一切的關鍵。但在古代，人們對事物的觀察隻能通過肉眼來實作，而人眼的辨識能力隻有0.1毫米左右，是以對許多事物的了解并不全面。大約一千年前，人們偶然發現透明晶體或寶石被研磨成可以放大圖像的"透鏡"，這是人眼觀察能力的第一次增強。
胡克使用的顯微鏡及其繪制的木材消火栓單元的示意圖
到1590年，荷蘭人詹森發明了世界上第一台顯微鏡。1665年，英國科學家Hulk（R. Hooke）使用顯微鏡觀察了植物的木栓組織，發現它由許多規則的小方塊組成，他繪制了觀察到的圖像并将其稱為細胞或英語細胞。後來荷蘭人Levin Hooker（A. Van Leeuwenhock本人）學會了研磨鏡片，制作顯微鏡，觀察微小植物和動物的結構，為生物學的發展做出了重大貢獻。從那時起，在顯微鏡的幫助下，生物學有了顯着的發展，可以觀察到更小的結構。
光學顯微鏡
但是這種顯微鏡，先是用光照在被觀察的物體上，然後經過反射光的處理，得到放大的圖像，是以我們一般都叫光學顯微鏡。但光學顯微鏡的放大能力有限，如今的光學顯微鏡隻能放大2000倍。顯微鏡的分辨率大約是可見光波長的一半，可見光的波長範圍是300到700納米，是以光學顯微鏡的理論最小分辨率是0.172微米，面對較小的結構無能為力。
顯微鏡的放大原理
随着科學技術的發展，光學顯微鏡不能滿足科學研究的需要。20世紀以後，量子力學取得了顯著的進步，人們對微觀粒子的了解也更近了一步。電子具有波粒二分法的特點，并具有幹涉和衍射等波動現象。通過加速電子，加速度電壓為50~100kV，此時電子的波長為0.0053~0.0037納米，遠小于可見光的波長。如果電子可以用作顯微鏡的媒體，則可以大大提高分辨率并觀察到更精細的結構。
1931年，德國人Knoller和Ruska使用冷陰極放電電子源和三個電子透鏡來修改高壓示波器，獲得了放大數十倍的圖像，證明了電子顯微鏡放大成像的可能性。Ruska改造後，電子顯微鏡的分辨率提高到50納米，大約是當時光學顯微鏡分辨率的十倍，電子顯微鏡開始受到關注。電子顯微鏡使人們能夠看到病毒和大分子，而它們後面發明的掃描隧道顯微鏡使人們可以看到原子的結構。
電子顯微鏡的組成由三部分組成：桶，真空系統和動力櫃。該筒包括電子光源、電子鏡頭、樣品架、熒光屏和檢測器。電子鏡頭是最重要的元件。光學顯微鏡中的凸透鏡使光束聚集，而電子透鏡使電子束聚集。現代電子顯微鏡主要使用電磁透鏡，允許電子通過強磁場聚集。
光學顯微鏡和電子顯微鏡原理的比較
投影電子顯微鏡的成像原理與光學顯微鏡基本相同，隻是它使用電子束作為光源，電磁場作為透鏡。由于電子束非常不透水，是以電子鏡中使用的标本必須制成約50納米厚的超薄切片。透射鏡是一種三維角散射，通過将加速和聚集的光束投射到非常薄的樣品上，其中電子與樣品中的原子碰撞并改變方向。散射角的大小與樣品的密度和厚度有關，是以可以形成不同的圖像，這些圖像被放大并聚焦在成像裝置上，例如熒光螢幕，膠片和光敏耦合元件。
現代電子顯微鏡
生物材料觀察> < II
電子顯微鏡需要高速電子來轟擊物質的表面，是以它們通常适用于"無生命"樣品。對于生物材料來說，它是易碎的，不能承受電子的轟擊，是以新發明的電子顯微鏡不能用于生物學研究。
1934年，Ladislaus Laszlo Marton使用電子顯微鏡檢查生物标本，并寫了兩種可能的解決方案：使用負染色或在低溫下冷卻生物材料。
20世紀40年代出現後，負染色逐漸得到改進，當時重金屬鹽離子形成無定形薄膜，然後嵌入生物分子中。重金屬鹽離子和生物分子具有不同的散射電子的能力，如圖像中所反映的那樣，其中白色生物分子樣品散射在黑色背景上。然而，該方法的分辨率受到重金屬鹽粒徑的限制。然而，在那些日子裡，使用負染色可以看到在普通光學顯微鏡下看不到的結構，是以它們在一些生物分子的三維結構和三維重建技術中仍然發揮着重要作用。現在陰性染色法在樣品預篩選和初始模型建構等方面仍得到廣泛應用。
但陰性染色隻能觀察到細胞器大小的結構，這些結構對于較小的單分子或分子複合物無能為力。
Marton的第二個想法是将生物樣品保持在低溫下，以便它們能夠承受更多的電子轟擊，并且解決了真空中生物樣品的脫水和變形問題。但水在低溫下形成結晶冰，導緻電子強烈衍射，導緻探測器收集幾乎所有的結晶冰信号，進而模糊生物分子的信号。水晶冰也會影響蛋白質的天然結構。大多數生物分子僅在水溶液中保持其自然的空間結構。是以，為了使生物樣品在低溫下保持自然，必須解決結晶冰的問題。
從理論上講，結晶冰形成的問題可以通過将液态水快速冷卻成玻璃（非結晶狀态）來克服。但20世紀80年代的理論預測表明，從大量的水相變中形成玻璃狀冰所需的冷卻速度很難實作。Myer在1980年的研究證明，在微米級具有快速冷凍尺寸的微滴可以轉化為玻璃冰。
在20世紀80年代，Jacques Duboche設計了一種可行的解決方案，将薄膜冷凍成玻璃薄膜。将含有樣品的溶液滴入處理過的銅網中，通過該層形成一層從納米到微米級的薄水膜，然後在-180°C溫度（液态乙烷或丙烷）下快速浸入，此時銅網絡上的薄水膜迅速當機成薄冰膜， 而生物樣品也固定在薄冰膜中。Dubose使用該系統制備許多不同種類生物分子的冷凍樣品，例如噬菌體，DNA，病毒，核糖體和其他冷凍樣品。結果表明，這種方法是可行且重複的。
雅克·杜博斯制備冷凍生物樣品的方法
<三>提高生物樣品的分辨率
DuBose的原型方法将電鏡生物學帶入了冷藏電鏡時代，為高分辨率結構的分析奠定了基礎。1990年，理查德·亨德森（Richard Henderson）和其他人成功地将細菌類視黃醇的分辨率提高到原子分辨率，使用基于冷凍樣品的方法的二維晶體。
亨德森首先使用X射線技術來分析生物分子的結構，但這種方法需要生物分子的結晶狀态，這些生物分子極難結晶。在幾次失敗之後，亨德森轉向了電子顯微鏡技術，該技術不需要生物分子結晶來解析其結構。
第一次觀測到的視覺紅質
細菌類視黃醇是一種特殊的蛋白質，它在一定條件下會形成整齊的紫色膜層，而紫色膜是二維晶體，因為蛋白質排列在單個平面上，不會在第三個方向上堆疊成三維。Henderson等人采取了一種不同的方法，将紫色薄膜直接制成樣品。這是尚未冷凍的樣品的概念，亨德森制作了一個溫度樣品，其中他添加了0.5%的葡萄糖溶液，以防止樣品在真空中變幹。
典型的生物樣品隻能用較低的電子劑量進行測試，進而導緻成像品質降低。二維晶體可以衍射電子，通過軟體處理提高成像品質。通過旋轉樣品，我們可以從不同角度獲得樣品的資料，并且可以通過晶體分辨率建構類視黃醇紅質的三維結構，化學晶體分析技術非常成熟。
通過上述方法，Henderson分析了膜結構到0.7nm的分辨率，并首次看到了膜蛋白的轉膜螺旋結構。後來，在制冷電鏡技術發展之後，亨德森也進行了大量的研究，并在1990年将類視黃醇的分辨率進一步提高到0.35nm。
1990年觀察到的視力發紅
亨德森的工作不僅是第一個将膜蛋白解析為原子級分辨率的工作，而且還通過制冷電鏡提高了對原子能級分辨率結構的信心。随後，還分析了膜蛋白的高分辨率結構，如光捕獲複合物，αβ二聚蛋白和水通道蛋白。
<星期四>檢視更多生物分子
然而，并非所有的生物分子都可以形成二維晶體，更多的生物分子隻能以單個分子的形式存在于溶液中。單分子三維結構的電鏡分析隻能通過單粒子冷藏電子鏡的三維重建來完成。
在20世紀70年代，約阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank）和其他人首次研究了低電子劑量下的圖像品質增強。Frank通過結合後疊加法提高圖像品質（增強的信噪比）來獲得谷氨酰胺合成酶的二維投影平均值。但是，生物分子在不同角度的二維投影是不同的，即使在同一方向上投影，不同構象産生的二維投影也是不同的。生物分子不同角度的投影需要單獨分類。通過查找投影特征點或特征區域，可以通過比較特征點或特征區域對它們進行分類。但是，在低品質的圖檔中尋找标志或特征區域也是一個挑戰。Frank和van Heel使用一種稱為多元資料分析的方法解決了。
分别為2011年（上圖）和2016年（下圖）相同生物分子的電鏡圖
從二維投影重建三維結構需要确定三維結構中每個二維投影的相對位置。1986年，Frank和Radermacher等人創造了一種稱為随機圓錐旋轉的方法，以确定二維投影在三維結構中的相對位置。
弗蘭克在理論上為電鏡生物學的發展做出了巨大貢獻，他還開發了電鏡處理軟體SPIDER。
直接電子檢測技術（DED）發明于21世紀初，不需要将電子信号轉換為光信号，而是直接檢測電子信号，減少了轉換過程中引入的噪聲量。2012年，将DED引入制冷鏡中，采用單顆粒制冷電鏡法，将轉膜蛋白TRPV1的結構分析至0.38nm。今天的單顆粒冷凍電子，334kDa的蛋白質結構分辨率為0.18nm，64kDa的蛋白質結構分辨率為0.32nm。
電鏡的發展
綜上所述，人們對生物體的了解是：生命-組織-細胞-細胞-器官-生物分子。自然界中的大多數生物都可以用肉眼觀察，身體的組織器官通過解剖學來了解，光學顯微鏡允許觀察細胞結構，電子顯微鏡允許進一步觀察器官的結構，直到制冷電子的發展，現在可以觀察到許多生物分子的結構。
總結三者的貢獻，杜博舍發明了采樣方法，使電鏡生物學進入制冷電鏡時代，為分析高分辨率結構奠定了基礎。亨德森的工作不僅是第一個将膜蛋白解析為原子級分辨率的工作，而且還通過制冷電鏡提高了對原子能級分辨率結構的信心。弗蘭克在理論上為電鏡生物學的發展做出了巨大貢獻，他還開發了電鏡處理軟體SPIDER。
資源
[1] https://www.nobelprize.org
李志飛， 高甯.制冷電鏡技術應用于生物分子高分辨率結構分析—— 2017年諾貝爾化學獎， 大學化學， 2018， 33 （01）： 1-6.