WRKY转录因子是一类参与多种植物过程的DNA结合蛋白，在响应非生物和生物胁迫中发挥关键作用。
全基因组差异分析WRKY基因家族在大麦为分子进化和功能角色提供了一个框架。迄今为止，来自大麦的WRKY的晶体结构仍未解决。
了解WRKY结构域的三维结构是探索蛋白质-DNA识别机制的先决条件。使用基于同源建模的方法来产生WRKY DNA结合结构域(DBD)及其变体的结构在WRKY1作为模板。
最后通过原子分子动力学(MD)模拟100 ns的时间周期，检测所生成的模型在未结合和结合形式下的稳定性和构象变化。
研究目的
大麦是世界上最早驯化和最重要的谷类作物之一。它本质上是二倍体，具有5.1 Gb的大基因组。大麦作物的生长、发育和产量受到不利条件和因素的限制，例如水分胁迫、盐度和极端温度。
几个转录因子家族已被证明参与了对这些不利应激条件的防御。WRKY家族是其中之一，并在响应生物和非生物胁迫的防御过程中在调节基因表达中起关键作用。第一WRKY基因(SPF1)在甘薯中得到鉴定，此后在各种植物物种中发现了它。
WRKY基因家族是植物界中最大且被广泛研究的转录因子基因家族之一。WRKY蛋白被描述为存在高度保守的WRKY DNA结合结构域(DBD)和独特的C2H2锌指基序。
WRKY蛋白的核心序列或DNA结合序列是WRKYGQK，在作物中有一些常见的变体。在水稻中，WRKY家族成员具有19个WRKY结构域的变体，其中WRKYGEK(七个)和WRKYGKK分别是七个和五个结构域共有的两个常见变体。
在大麦中保守的WRKY结构域具有其它形式，根据WRKY结构域的数目和锌指样基序的类型，WRKY蛋白被分为三类。具有两个WRKY结构域的那些属于组I。而具有单个WRKY结构域的那些属于组II和III。
该结构域与W-box DNA基序(TTGACT/C)结合，该基序位于下游基因的启动子区域并调节信号级联。WRKY蛋白参与调节基因表达以防御病原体、植物生长和发育、衰老、生物合成和激素调节、干旱、寒冷和盐。
在生理过程中，WRKY基因通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)磷酸化来调节。WRKY74来自水稻调节水稻体内磷平衡、铁饥饿和冷胁迫。
WRKY71从拟南芥(At)通过激活调节枝条分枝RAX另一方面，通过调节开花蝗虫和多叶基因来提高开花率。 WRKY46从A.唐松草通过调节ABA信号和生长素体内平衡来促进渗透/盐胁迫下侧根的生长。
蛋白质-DNA相互作用在将基因组信息翻译成生物学意义上起着重要的作用。由于蛋白质对特定DNA序列的识别非常复杂，很难通过实验方法预测这些蛋白质如何与DNA相互作用。
因此，使用时间和成本有效的计算技术，如分子动力学(MD)模拟、对接研究，在这种情况下需要加速知识恢复的过程，并缩小实验方案的搜索空间。
WRKY结构域和W-box DNA的复合晶体结构拟南芥At使用NMR方法(2LEX和2LEX)解析WRKY1蛋白质。最近在拟南芥DNA结合特异性在不同的在使用10 ns分子动力学和体外实验研究了WRKY基。
我构建了一个基于同源性的WRKY蛋白模型和大麦WRKY及其变体的比较分子动力学模拟，以了解WRKY转录因子的分子机制以及这些转录因子的DNA结合区如何与DNA相互作用。研究的结果可能会为未来的研究提供一个平台WRKY大麦中响应胁迫的基因。
WRKY结构域及其复合物的分子动力学模拟
使用Gromacs 5.0软件包对野生型和变体WRKY结构域进行MD模拟。对于未结合和结合的WRKY DBDs模拟AMBER99SB-ILDN蛋白，应用了核酸AMBER94力场。所有的系统都在立方体水盒中使用简单点电荷(SPC)水模型溶解。
加入离子，通过取代水分子来中和整个系统，确保野生型和变体(I和II) WRKY DBD的总体电荷中性。为了消除空间冲突，执行能量最小化50，000次循环的最速下降算法。使用我们之前工作中提到的类似方法，将进一步最小化的系统平衡为1000 ps的NVT和NPT相。
随后系统的温度(300 K)和压力(1巴)使用Vrescale维持和帕里诺-拉赫曼压力耦合法分别。最后，平衡良好的系统在300 K和1巴压力下进行100，000 ps的生产运行。
野生型和变体(I和II) WRKY DBD的每个残基的动态行为和稳定性，包括均方根偏差(RMSD)、回转半径(Rg)、均方根波动(RMSF)、溶剂可及表面积(SASA)和Gromacs内置工具的氢键轮廓。
使用Gromacs的gmx-cluster模块RMSD构象聚类算法提取代表性结构。应用2.0的截止值，并通过考虑质心最低RMSD的蛋白质构象提取最大占据簇。
序列分析和表达模式
WRKY结构域由60-70个氨基酸残基长的DBD组成，其特征在于高度保守的七肽WRKYGQK基序。我选择了超速WRKY46第一组成员，在N-和C-末端都有两个DBD，但只有C-末端WRKY结构域负责与DNA的序列特异性结合。
超速来自组III的WRKY34具有WRKYGEK基序，被称为变体I超速来自组II的WRKY19包含WRKYGKK基序被称为变体II。
基于这些替换，相应的序列在WRKY结构域的分子系统发育分析中显示出差异，并且在大麦中被分类到不同的组中。
以前，已经证明将WRKYGQK肽中的任何残基替换成丙氨酸，都显着地消除了DNA结合活性。为了检验取代对蛋白质功能、结构特性和DNA结合模式的影响，已经进行了广泛的计算分析。
野生型WRKY DBD的分子对接分析
分子对接是结构生物学中用来探索两个分子间相互作用残基的可靠方法之一。使用聚类算法提取的代表性结构与DNA对接表示“在这一边”调控基序。
HADDOCK web服务器分别为wild和variant I和variant II生成了5、9和6个集群。对于野生型(58%)和变体I (49%)，簇1的大小最大，而观察到簇2对于变体II (42%)具有大的大小。
基于黑线鳕分数对聚类进行分类；在所有聚类中，基于最高黑线鳕评分选择最佳评分复合物，用于绘制蛋白质-DNA相互作用。HADDOCK分数是范德华力、静电能、去溶剂化能和约束破坏能的加权和，而Z分数表示从簇中选择的复合物的可靠性。
对于每个蛋白质模型，生成了黑线鳕分数对i-lRMSD图。iRMSD使用10的截止值对参与分子间接触的所有残基的主链原子进行计算。lRMSD是根据所有(N> 1)分子先贴合在主链原子后静电势分子表面提供了对分子的分子特性的了解。
对于野生型WRKY DBD，基于最高黑线鳕评分(90.5±0.9)和Z评分，聚类1被选为最佳对接复合体。.在WRKY-DNA复合物中，单个锌原子分别与Cys32、Cys37 (C2)、His61和His63 (H2)配位。
WRKY DBD通过β折叠(β1)的高度保守的β1链与DNA的大沟结合，因为标志WRKYGQ (/K/E/) K基序位于结构域的β1链内。野生型WRKY-DNA复合物通过形成由残基Arg13、Gln17、Lys18、Lys31和Arg40形成的七个氢键(H-键)以及两个疏水相互作用(Val19和Pro26)而稳定。
PBSA结合自由能的计算
通过MM-PBSA，一种有价值的结合自由能确定工具，基于蛋白质对DNA的结合亲和力对蛋白质-DNA复合物进行分级。进行MM/PBSA计算以计算14种不同蛋白质-DNA复合物的结合自由能拟南芥从稳定的5 ns MD模拟轨迹。
揭示了atwrky 1 cDBD–DNA复合物中的特异性结合。基于野生型和变体的100 ns分子动力学轨迹，结合自由能分析及其相应的组成部分通过MM/PBSA计算进行分析，并记录在表中。
结果表明野生型表现出相对高的结合自由能值-500.22 kJ/mol，与变体I和II相比，其自由能值分别为-482.61和-453.04 kJ/mol。因此，点突变减少了正极项，导致促进复合物形成的负极项总体增加。分别提供了野生型、变体I和变体II的每个残基对结合能的贡献。
在野生型和变体II中观察到保守七肽(WRKYGQK)做出主要贡献，而在变体I中主要贡献是来自七肽的Lys18。包括范德华力、静电相互作用和非极性溶剂化能在内的结合自由能分量产生负面影响，有利于复合物的形成。
结论
为了更好地理解WRKY DBD识别DNA的结构基础，整合了分子和本质动力学方法。根据大麦WRKY结构域的晶体结构，通过同源建模构建了其三维结构拟南芥WRKY。
在100 ns模拟轨迹上，使用不同的工具来检查野生型和变体复合物的分子行为。RMSD、RMSF和Rg分析完成了所有未结合和结合形式的WRKY结构域的结构验证。
基于RMSD和RMSF的分析，我们证实了与野生型和未结合形式的变体II相比，变体I显示出更高的偏差和波动。为了研究点突变对蛋白质结构和功能的影响，在野生型和变异复合物的WRKY DBDs和DNA之间进行了分子对接。
氢键和疏水相互作用在稳定蛋白质和DNA相互作用中起着重要作用。从100 ns的分子动力学模拟中，我得出结论，WRKY DNA结合结构域中保守氨基酸残基的突变，改变了WRKY蛋白的天然行为和与DNA的相互作用模式以及复合物的稳定性。
总之我研究了保守残基如Trp12、Arg13、Lys14、Glu17和Lys18的独特功能作用，强调了WRKY家族的DNA识别机制，这导致了它们对确定的靶基因的潜力的调节。我们的结果为蛋白质-DNA结合特异性的结构和热力学成因提供了有效的新的基本见解。
因此对基因组中转录因子结合位点的预测具有重要的意义。它还提出这些突变可能对转基因植物的发育有异常影响，因此在转基因植物发育表型的发育过程中应该避免。