“卢沟桥事变”后，北京大学撤离北平，周作人没有同行，选择留校，并与日本人在文化上达成了合作，给他们翻译著作，从而保护了校产。1939年初，周作人接下汪精卫南京政府国立北京大学图书馆馆长的聘书，成为该大学的图书馆馆长。1940年11月，汪精卫政权华北政务委员会教育总署督办汤尔和因肺癌去世，次月汪精卫政权中央政治委员会决定特派周作人接替其职位，于1941年的元旦正式上任。同年10月，周作人被任命为东亚文化协议会会长，之后又兼任华北综合调查研究所副理事长、中日文化协会理事等职。
1945年12月，国民政府以汉奸罪名逮捕了在北平的周作人，押送到南京受审，关在老虎桥监狱中。其学生和朋友纷纷为他开脱求情，甚至有人还给胡适写了一封长信，让他提周作人说情。无论如何，周作人曾经做的那些事，逃脱不了法律的制裁和道德的审判，60岁的他被判处有期徒刑10年。
新中国成立前夕，释放政治犯时，周作人也被释放，并到上海的学生家中暂住。1949年8月，他回到北平，此时北平已经被解放军掌管。之后，他给领导人写了一封一千六百多字的信，表达了自己对过去的检讨和解释。领导人看完这封信后说：“周作人是文化汉奸，既没有杀人又没有放火。现在懂希腊文的人不多了，将他养起来，做翻译工作，以后出版。”就这样，周作人开始了他的翻译生活。当然，他每月都有工资可以拿，相较于抗日战争时期舒适安逸的生活来说，现在的生活有些拮据。尤其是妻子去世后，周作人的生活更加艰难。
1967年5月6日，周作人下地解手时，突然发病去世，中年82岁。他去世后，家人通知鲁迅唯一的儿子周海婴前来参加叔叔的葬礼。周海婴思考再三后，最终选择了不来参加周作人的葬礼，也没有和叔叔做最后的告别。这也印证了周作人当初与鲁迅诀别时留下的话：永不相见，与鲁迅决裂后，和哥哥一家彻底断了来往。