“盧溝橋事變”後，北京大學撤離北平，周作人沒有同行，選擇留校，并與日本人在文化上達成了合作，給他們翻譯著作，進而保護了校産。1939年初，周作人接下汪精衛南京政府國立北京大學圖書館館長的聘書，成為該大學的圖書館館長。1940年11月，汪精衛政權華北政務委員會教育總署督辦湯爾和因肺癌去世，次月汪精衛政權中央政治委員會決定特派周作人接替其職位，于1941年的元旦正式上任。同年10月，周作人被任命為東亞文化協定會會長，之後又兼任華北綜合調查研究所副理事長、中日文化協會理事等職。
1945年12月，國民政府以漢奸罪名逮捕了在北平的周作人，押送到南京受審，關在老虎橋監獄中。其學生和朋友紛紛為他開脫求情，甚至有人還給胡适寫了一封長信，讓他提周作人說情。無論如何，周作人曾經做的那些事，逃脫不了法律的制裁和道德的審判，60歲的他被判處有期徒刑10年。
新中國成立前夕，釋放政治犯時，周作人也被釋放，并到上海的學生家中暫住。1949年8月，他回到北平，此時北平已經被解放軍掌管。之後，他給上司人寫了一封一千六百多字的信，表達了自己對過去的檢讨和解釋。上司人看完這封信後說：“周作人是文化漢奸，既沒有殺人又沒有放火。現在懂希臘文的人不多了，将他養起來，做翻譯工作，以後出版。”就這樣，周作人開始了他的翻譯生活。當然，他每月都有工資可以拿，相較于抗日戰争時期舒适安逸的生活來說，現在的生活有些拮據。尤其是妻子去世後，周作人的生活更加艱難。
1967年5月6日，周作人下地解手時，突然發病去世，中年82歲。他去世後，家人通知魯迅唯一的兒子周海嬰前來參加叔叔的葬禮。周海嬰思考再三後，最終選擇了不來參加周作人的葬禮，也沒有和叔叔做最後的告别。這也印證了周作人當初與魯迅訣别時留下的話：永不相見，與魯迅決裂後，和哥哥一家徹底斷了來往。