檢測動物源性食物中的寄生蟲 - 囊尾礦

囊尾幼蟲是蚜蟲的幼蟲，寄生在宿主的橫紋肌肉和結締組織中，呈袋狀，俗稱"囊蟲"。動物體内有許多種寄生性觸覺，它們通過肉制品傳播給人類，包括豬囊尾和牛囊，這更常見。囊尾病廣泛分布于世界範圍，在開發中國家很常見。由于開發中國家衛生基礎設施不完善，囊性内分泌病在豬群和種群中發病率較高，造成巨大的經濟損失。近年來，由于移民和國際遊客數量的增加，工業化國家囊性内球菌的發病率也有所增加。1993年，其豬囊尾病被世界衛生組織列為有待根除的六大疾病之一。

1 病原體特征

尾纖症更寄生于舌肌，咬肌，髋部肌肉，深腰肌和胫肌。外觀呈橢圓形囊泡狀，大小為（6~10）mm×5mm，囊内充滿液體，囊壁為薄膜，内側有圓粒狀乳白色，頭部有4個吸盤。一些囊尾在頭部頂部有一個頂部突出物，在頂部突出部分的前部有許多鈎子，排列成兩個圓圈。由于其肉眼可見的外觀，乳白色，半透明，綠化或大豆大小，它被稱為"米豬肉"或"豆豬肉"。

2 流行病學特征

豬囊尾病主要是豬之間傳播的人畜共患疾病，又稱豬囊性病，該病的患病與人們的生活習慣有很大關系。與豬囊尾相對應的成蟲是豬縧蟲。人是唯一的臨終宿主，是以蚴蚴病的唯一感染源是小腸中豬縧蟲寄生蟲患者。豬是中間宿主，豬縧蟲病的感染源是豬有尾辮的豬。此外，人們還可以作為中間宿主感染豬囊尾尾。豬縧蟲的主要原因是豬的繁殖松散或對人體糞便管理不善，導緻豬吃妊娠或豬縧蟲患者糞便中的雞蛋，進而感染豬囊尾。人囊性内球菌病有兩個主要病因：一是口腔感染。人們吃被蚜蟲卵污染的食物和水，如用人糞澆灌蔬菜，吃未洗過的蔬菜帶雞蛋而生病，或者患有豬縧蟲病的患者不洗手或不洗幹淨，誤食手上沾染的雞蛋，感染豬縧蟲病。另一種是自我感染。對于小腸内有豬縧蟲寄生蟲的患者，在某些情況下，蚜蟲脫落的構造在胃上逆行，在消化液的作用下，卵的蛋殼被消化，幼蟲被轉移到組織器官，導緻人們感染豬囊尾病。

囊尾尾礦分布于全球，但主要分布在亞洲、非洲和拉丁美洲的一些國家和地區。在我國，除東北、華北、西北以及雲南、廣西部分地區外，其餘地區分布較多，長江以南地區較少，東北地區感染率較高。除浙江省外，除中國浙江省外，所有省份都報告了蚜蟲感染病例。近年來，各地感染人數不斷增加，感染率比1990年提高52.47%，西藏和四川省的感染率分别增加97%和98%，牧民主要以生牛肉為主感染牛縧蟲病。豬縧蟲病在黑龍江的感染率最高，而牛縧蟲病在西藏尚屬首創，個别地區感染率超過70%。

3 危害

囊尾病可感染豬和人。囊性内球菌病人群感染率低，但豬感染率高，在我國各省發生并普遍存在，分布廣泛，部分地區流行，其中東北、華北、西南地區最受歡迎。豬囊尾病對豬的危害主要是阻礙豬的生長發育，特别是影響幼豬的生長。輕度豬囊尾病在臨床上不易發現，隻有當豬在嚴重感染時才出現症狀，如豬肌肉僵硬、肩肌水腫、肩部張寬、臀部凸起，出現異常肥胖，而體中部狹窄，呈獅子狀或啞鈴狀。如果囊在舌頭上寄生，則難以咀嚼和吞咽，如果在喉嚨中，聲音嘶啞：寄生蟲在眼睛中，視力模糊，如果寄生蟲在大腦中，則有痙攣，或由于急性腦炎而猝死。該病不僅嚴重影響養豬業的發展，給養豬業造成巨大的經濟損失，而且威脅到人類的健康。一方面，人類囊性内隐患可使人感染豬縧蟲的機率大大提高，豬縧蟲寄生在小腸内，導緻貧血、消瘦、腹痛、消化不良、腹瀉等症狀;糖精寄生蟲可在人體肌肉中出現酸痛和僵硬，神經系統症狀可能發生在大腦中，抽搐，癫痫，癱瘓甚至死亡，并且眼睛受壓可導緻視力喪失甚至失明。其中，腦囊性内分泌性疾病是危害最嚴重的，是開發中國家繼發性癫痫最常見的病因。全世界約有5000萬人患有腦囊性内征，其中80%以上生活在低收入和中等收入國家，每年有5萬多人死于這種疾病。

豬囊尾病和人豬膠帶蚜蟲病是寄生蟲病，在豬和人之間形成因果和循環感染，如果衛生環境控制措施不嚴，可能導緻惡性循環。豬縧蟲病患者每天被排除在懷孕和雞蛋之外，并且可以持續數年甚至更長時間，使豬不斷受到威脅。人是豬縧蟲唯一的臨終宿主，豬縧蟲感染主要取決于飲食衛生習慣和烹饪以及食肉方法。人們通過食用帶有活囊尾的豬肉或受污染的食物感染豬縧蟲病。流行地區的居民，如生豬肉或未成熟的豬肉和牛肉，它們在蚜蟲病的傳播中起着決定性的作用。人囊性内球蟲病是由食用被豬縧蟲卵污染的食物或豬縧蟲病患者自身感染引起的，豬縧蟲患者有16%~25%并發囊性内球菌病。是以，囊尾精神病是嚴重危害人體的寄生蟲病之一。

4 國内外衛生要求

根據《牲畜和家禽屠宰衛生檢疫守則》（NY467-2001），屠宰豬囊尾的主要檢查點是咬傷肌、深腰肌和胫肌，而其他可檢測部位是心肌、肩胛骨外側肌肉和股骨内肌。根據國家标準GB16548-2006的有關規定，"凡發現囊尾斑和鈣化蠕蟲的，全身用于工業用途或破壞。"

5 檢測方法

5.1 病原體檢測

5.1.1 牲畜檢測

豬囊尾的活體檢查部位主要是舌肌和眼肌。用專用的開瓶器或木棍等工具撬開豬嘴，一手墊一塊厚布将舌頭拉出仔細觀察，并觸摸舌底、舌側、舌根無囊結，摸觸感彈性豆合成為囊，其檢出率約為30%。在檢查眼睛的外層肌肉時，用拇指和食指捏住眼睛結膜和眼睛的外層皮膚，并感覺到突起最初可以判斷為囊。

5.1.2 屠宰後的肉類測試

豬屠宰檢驗後，按照《肉類衛生檢驗試驗規程》的要求，切開咬肌、舌肌、心肌、深腰肌等部位，可見豆粒或米粒大小的囊泡，橢圓形、白色透明，囊中含有半透明液體和米粒大白頭段。扒取皮下結節，用薄膜剝離外層纖維，将蟲體直接在鏡面下觀察，囊壁分為兩層，外皮層、内間質層，間隙層向囊增厚，形成頭部向内滾動收縮，其結構類似于成蟲的頭部。如有必要，做片劑，固定，脫水，透明，染色後識别。

5 . 2 皮内反應

取鮮豬肉在囊尾繭頭段發育成1：100懸浮液。注射豬耳朵外褶部分用0.1~0.2mL進行檢查，反應開始5min後判斷：注射部位出現發紅，直徑超過11mm，45min開始消退，陽性;

5.3 血清學檢測

囊性内蚴病的診斷過程較為複雜，難以獲得準确的診斷結果，容易漏診，是以經常采用血清學和免疫學檢查方法輔助囊性内蚴病的診斷和鑒定。實驗室用于診斷豬囊尾病的方法有：補體結合反應、沉澱反應、間接紅細胞凝血試驗和酶聯免疫吸收試驗。互補結合反應長期以來一直用于囊性終球菌病的診斷，但由于假陽性率高，已逐漸被其他方法取代。沉澱反應包括液相沉澱反應和固相沉澱反應，存在檢出率過低的缺點，無法通過該方法診斷囊性内蚴病。目前常見的檢測方法有間接紅細胞凝血試驗和酶聯免疫吸收試驗。

5.3.1 間接紅細胞凝血試驗

間接紅細胞凝血試驗（IHAT）是紅細胞作為免疫配體的載體和紅細胞凝血讀數的血清學方法。最常用的紅細胞是綿羊紅細胞或人（O型）紅細胞，它們很容易獲得。目前，全部使用醛類紅細胞，可以儲存半年而不會失去免疫吸收性能。步驟如下：

（1）紅細胞鞣制和過敏性醛取紅細胞用0.15mol/L PBS（pH7.2）離心洗滌2次，用PBS沉澱2.5%懸浮液;2000年酸溶液（不同批号的钽酸，品質差異必須預先測試以确定适當的濃度）37°C孵育20min，經常搖晃;離心至液體，用PBS洗滌1次，然後用0.15mol/L的PBS（pH6.4）裝有10%懸浮液，每次懸浮液均适當稀釋抗原液，置于37°C水浴槽中30min（每5分鐘振動1次），離心脫液，用PBS洗滌2次（pH7.2），再與1%正常兔血清（NRS）和10%蔗糖緩沖液混合至5%細胞懸浮液。加入0.1%一疊防腐的氮化鈉，在4°C下儲存或減壓凍幹備用，已知每批過敏性細胞的血清滴定靈敏度或特異性為陽性和陰性。陽性滴度在1：640以上，陰性血清似乎對可用沒有反應。

（2）痕量吸盤試驗 在U形（或V形）微槽中，試驗血清将用1%NRS或牛血清白蛋白（BSA）生理鹽水稀釋，比該系列更均勻，稀釋血清為每孔0.05mL。向緻敏性紅細胞懸浮液中每孔加入0.01mL（可校準注射器針滴加），充分振蕩和搖動良好，覆寫室溫靜态1~2h讀數結果。

取決于沉積在孔底部的紅細胞的類型。"-"，紅細胞沉積在管的底部，波點形，光滑的外周，"±"，紅細胞沉積在管的底部，周圍不光滑或在中心有小白點紅細胞具有較小的沉積範圍，其中會出現微弱的環;顯著陽性檢測的最高稀釋度是血清的滴定或功效。間接紅細胞凝血試驗檢測腦脊液或血清抗體滴度大于正常參考值的上限，即血清凝血滴定<1：8，腦脊液<1：2，可診斷為腦囊疾病，陽性率為78%~91.4%。

5.3.2 酶聯免疫吸收試驗

目前，内蚴病最可靠的診斷方法是酶免疫吸附技術。酶聯免疫吸收試驗（ELISA）的早期建立廣泛用于豬的鈍病診斷。在此基礎上，開發了斑點酶聯免疫吸附試驗、生物素親和酶聯免疫吸附試驗、抑制酶聯免疫吸附試驗等。此外，還成功開發了利用酶聯免疫原理和膠體金斷層掃描技術快速診斷囊尾尾病的技術。酶聯免疫吸收試驗檢出率高，特異性強，穩定性好，已列入我國動物檢疫程式，具體程式如下：

（ 1 ）将豬的全血片以10cm×1cm的普通過濾條，一端标明豬号，另一端從被測豬的任何部位吸收 1~2 滴血，室内幹燥後，置于4°C的冰箱中（可貯存 6 個月）。

（2）将ELISA反應闆用抗原包洗滌3次。将抗原通過溶液稀釋至工作濃度的抗原并加入到ELISA反應闆孔中，每個孔0.1mL，覆寫并置于室溫（11至29°C）下過夜。

（3）用力搖動袋，通過隔夜ELISA反應闆孔中的抗原包裝液，每孔加入洗滌液，浸泡3min，強制抖落洗滌液，并用濾紙除去殘留的洗滌液并除去孔中的氣泡，重新加入洗滌液，按相同方法共洗滌3次， 即3×3分鐘沖洗。

（4）将驗血片、标準陰性血片和标準陽性血片切成1cm×1cm大小，分别放入青黴素瓶中，每1cm×1cm血片加稀釋0.3mL，浸泡20min，即血片變白後。

（5）每片血片浸出液加2孔，每孔0.1mL。标準陰性、标準陽性對照孔加相應的血闆滲濾液2孔，每孔0.1mL。空白控制孔加稀釋2孔，每孔0.1mL。加入樣品并蓋上蓋子後，在室溫（11至29°C）下放置30min，并按照（2）方法用洗滌液洗滌。

（6）辛辣根過氫酶标記金黃色葡萄球菌蛋白A（HRP-SPA）标準品按說明書稀釋至工作濃度。經過測試的孔、标準負孔和标準正孔，每個孔 0.1mL，帶 HRP-SPA 标記。空白控制孔也增加了0.1mL。加入蓋子後，在室溫（11至29°C）下放置30min，并按照（2）方法用洗滌液洗滌。

（7）每個孔加現成的基闆溶液0.1mL，室溫（11~29°C）放置10min。

（8）每孔加入2滴終止液，終止反應。

（9）确定在建立控制孔的前提下，即标準正孔為深黃色，标準負孔為無色或淺黃色，空白孔為無色，測定試驗結果。視覺前判定：與标準負孔相比，顔色比标準負孔深，即豬被判定為ELISA陽性。它也可以通過酶聯免疫測定（490nm）測定。使用空白控制孔進行歸零可确定檢測到的孔的外徑值。當OD≤0.22時，判斷為ELISA陰性（-），OD≥0.26，判斷為ELISA陽性（加），當OD為0.23≤≤0.25時，确定為ELISA疑似（±），對嫌疑人進行一次複試，對嫌疑人仍為陽性。

囊尾抗體檢測僅反映寄生蟲的存在，而抗原檢測可以表明寄生蟲在體記憶體活。理想情況下，測試兩者的組合。血清學檢測中使用的各種天然抗原來自囊，這些天然抗原也可以用作有用的血清學篩查工具。不同的方法使用不同的可溶性抗原，使測試結果難以比較。囊尾病的檢測抗原多為豬囊尾囊液粗抗原或斷層掃描純化抗原，主要包括以下幾類：（1）扁豆凝血純化抗原成分（豬囊尾13ku、14ku 18ku、21ku、24ku、39~42ku或50ku糖蛋白）;(2）囊囊抗原組合物;

在人類或動物感染囊尾後，可以在血清，腦脊液，唾液甚至眼淚中檢測到抗體。輻射免疫，血液凝固試驗，膠體金，補體結合，酶聯免疫反應和免疫列印技術已被用于檢測受感染的人或動物囊性内分泌抗體。初始抗原來源于囊、排洩物G分泌物（ES）産物或粗漿，這些未申報的抗原敏感性和特異性較差，容易出現假陽性、假陰性和交叉反應;最佳特異性方法是酶聯免疫電轉移印記（EITB）技術，最初報道該技術具有100%特異性和98%敏感性。然而，這種方法在診斷大腦中單個囊腫疾病時的敏感性顯着降低。Prabhakaran等人報道了一種靈敏的免疫診斷方法（尿素誘導扁豆凝固的三階段組成）。該方法診斷出60例豬囊尾病患者，其中46%檢測出血清中存在抗體，标準免疫印迹診斷方法檢測呈陰性。這種商業化的EITB試劑盒可以直接購買，已被廣泛用于診斷人和豬的囊尾礦，但該方法也有一定的缺點，如抗原來源無法保證，抗原制備困難，抗原之間存在差異，探針雜交技術昂貴。為了解決這些問題，對這些抗原進行了鑒定、分析和合成，并利用LISA進行了豬囊尾病的診斷試驗。ElISA測試顯示，這些合成蛋白的特異性和敏感性遠低于天然糖蛋白抗原（LLGP）蛋白。Prasad報道了一種用于檢測囊性抗原誘導的淋巴細胞增殖的新免疫診斷技術。該技術基于囊性液體抗原，通過淋巴細胞增殖試驗測量囊性内球菌刺激體内的細胞免疫反應。研究人員報告說，測試組48名和對照組79名的特異性和敏感性分别為93.8%和96.2%。

檢測囊性尾礦的另一種方法是檢測抗原。目前，研究人員已經建立了幾種檢測血清中囊尾藻抗原的檢測方法。B158/B60 和 HP10 單克隆抗體已經過驗證，并用于囊性内克隆抗原的正常檢測，據報道囊性内克隆抗原非常敏感，血清樣本為 80%，腦脊液高達 90%。在sactas的流行病學調查中，研究人員計算了B158 / B60和HP10的敏感性和特異性，B158 / B60和HP10的敏感性分别為84%和76%，分别為55%和83%。B158/B60在人尿抗原檢測中也具有良好的診斷性能，寄生敏感性為92%（而單囊性終末植菌感染病例數降至62.5%）。隻有大多數鈣化囊尾礦患者（83%）檢測呈陰性。血清和尿液診斷結果的一緻性非常好，是以在檢測過程中可以用尿液或唾液作為診斷樣本代替腦脊液、血清樣本，可以大大簡化囊性内分泌疾病的篩查過程。