检测动物源性食物中的寄生虫 - 囊尾矿

囊尾幼虫是蚜虫的幼虫，寄生在宿主的横纹肌肉和结缔组织中，呈袋状，俗称"囊虫"。动物体内有许多种寄生性触觉，它们通过肉制品传播给人类，包括猪囊尾和牛囊，这更常见。囊尾病广泛分布于世界范围，在发展中国家很常见。由于发展中国家卫生基础设施不完善，囊性内分泌病在猪群和种群中发病率较高，造成巨大的经济损失。近年来，由于移民和国际游客数量的增加，工业化国家囊性内球菌的发病率也有所增加。1993年，其猪囊尾病被世界卫生组织列为有待根除的六大疾病之一。

1 病原体特征

尾纤症更寄生于舌肌，咬肌，髋部肌肉，深腰肌和胫肌。外观呈椭圆形囊泡状，大小为（6~10）mm×5mm，囊内充满液体，囊壁为薄膜，内侧有圆粒状乳白色，头部有4个吸盘。一些囊尾在头部顶部有一个顶部突出物，在顶部突出部分的前部有许多钩子，排列成两个圆圈。由于其肉眼可见的外观，乳白色，半透明，绿化或大豆大小，它被称为"米猪肉"或"豆猪肉"。

2 流行病学特征

猪囊尾病主要是猪之间传播的人畜共患疾病，又称猪囊性病，该病的患病与人们的生活习惯有很大关系。与猪囊尾相对应的成虫是猪绦虫。人是唯一的临终宿主，因此蚴蚴病的唯一感染源是小肠中猪绦虫寄生虫患者。猪是中间宿主，猪绦虫病的感染源是猪有尾辫的猪。此外，人们还可以作为中间宿主感染猪囊尾尾。猪绦虫的主要原因是猪的繁殖松散或对人体粪便管理不善，导致猪吃妊娠或猪绦虫患者粪便中的鸡蛋，从而感染猪囊尾。人囊性内球菌病有两个主要病因：一是口腔感染。人们吃被蚜虫卵污染的食物和水，如用人粪浇灌蔬菜，吃未洗过的蔬菜带鸡蛋而生病，或者患有猪绦虫病的患者不洗手或不洗干净，误食手上沾染的鸡蛋，感染猪绦虫病。另一种是自我感染。对于小肠内有猪绦虫寄生虫的患者，在某些情况下，蚜虫脱落的构造在胃上逆行，在消化液的作用下，卵的蛋壳被消化，幼虫被转移到组织器官，导致人们感染猪囊尾病。

囊尾尾矿分布于全球，但主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲的一些国家和地区。在我国，除东北、华北、西北以及云南、广西部分地区外，其余地区分布较多，长江以南地区较少，东北地区感染率较高。除浙江省外，除中国浙江省外，所有省份都报告了蚜虫感染病例。近年来，各地感染人数不断增加，感染率比1990年提高52.47%，西藏和四川省的感染率分别增加97%和98%，牧民主要以生牛肉为主感染牛绦虫病。猪绦虫病在黑龙江的感染率最高，而牛绦虫病在西藏尚属首创，个别地区感染率超过70%。

3 危害

囊尾病可感染猪和人。囊性内球菌病人群感染率低，但猪感染率高，在我国各省发生并普遍存在，分布广泛，部分地区流行，其中东北、华北、西南地区最受欢迎。猪囊尾病对猪的危害主要是阻碍猪的生长发育，特别是影响幼猪的生长。轻度猪囊尾病在临床上不易发现，只有当猪在严重感染时才出现症状，如猪肌肉僵硬、肩肌水肿、肩部张宽、臀部凸起，出现异常肥胖，而体中部狭窄，呈狮子状或哑铃状。如果囊在舌头上寄生，则难以咀嚼和吞咽，如果在喉咙中，声音嘶哑：寄生虫在眼睛中，视力模糊，如果寄生虫在大脑中，则有痉挛，或由于急性脑炎而猝死。该病不仅严重影响养猪业的发展，给养猪业造成巨大的经济损失，而且威胁到人类的健康。一方面，人类囊性内隐患可使人感染猪绦虫的概率大大提高，猪绦虫寄生在小肠内，导致贫血、消瘦、腹痛、消化不良、腹泻等症状;糖精寄生虫可在人体肌肉中出现酸痛和僵硬，神经系统症状可能发生在大脑中，抽搐，癫痫，瘫痪甚至死亡，并且眼睛受压可导致视力丧失甚至失明。其中，脑囊性内分泌性疾病是危害最严重的，是发展中国家继发性癫痫最常见的病因。全世界约有5000万人患有脑囊性内征，其中80%以上生活在低收入和中等收入国家，每年有5万多人死于这种疾病。

猪囊尾病和人猪胶带蚜虫病是寄生虫病，在猪和人之间形成因果和循环感染，如果卫生环境控制措施不严，可能导致恶性循环。猪绦虫病患者每天被排除在怀孕和鸡蛋之外，并且可以持续数年甚至更长时间，使猪不断受到威胁。人是猪绦虫唯一的临终宿主，猪绦虫感染主要取决于饮食卫生习惯和烹饪以及食肉方法。人们通过食用带有活囊尾的猪肉或受污染的食物感染猪绦虫病。流行地区的居民，如生猪肉或未成熟的猪肉和牛肉，它们在蚜虫病的传播中起着决定性的作用。人囊性内球虫病是由食用被猪绦虫卵污染的食物或猪绦虫病患者自身感染引起的，猪绦虫患者有16%~25%并发囊性内球菌病。因此，囊尾精神病是严重危害人体的寄生虫病之一。

4 国内外卫生要求

根据《牲畜和家禽屠宰卫生检疫守则》（NY467-2001），屠宰猪囊尾的主要检查点是咬伤肌、深腰肌和胫肌，而其他可检测部位是心肌、肩胛骨外侧肌肉和股骨内肌。根据国家标准GB16548-2006的有关规定，"凡发现囊尾斑和钙化蠕虫的，全身用于工业用途或破坏。"

5 检测方法

5.1 病原体检测

5.1.1 牲畜检测

猪囊尾的活体检查部位主要是舌肌和眼肌。用专用的开瓶器或木棍等工具撬开猪嘴，一手垫一块厚布将舌头拉出仔细观察，并触摸舌底、舌侧、舌根无囊结，摸触感弹性豆合成为囊，其检出率约为30%。在检查眼睛的外层肌肉时，用拇指和食指捏住眼睛结膜和眼睛的外层皮肤，并感觉到突起最初可以判断为囊。

5.1.2 屠宰后的肉类测试

猪屠宰检验后，按照《肉类卫生检验试验规程》的要求，切开咬肌、舌肌、心肌、深腰肌等部位，可见豆粒或米粒大小的囊泡，椭圆形、白色透明，囊中含有半透明液体和米粒大白头段。扒取皮下结节，用薄膜剥离外层纤维，将虫体直接在镜面下观察，囊壁分为两层，外皮层、内间质层，间隙层向囊增厚，形成头部向内滚动收缩，其结构类似于成虫的头部。如有必要，做片剂，固定，脱水，透明，染色后识别。

5 . 2 皮内反应

取鲜猪肉在囊尾茧头段发育成1：100悬浮液。注射猪耳朵外褶部分用0.1~0.2mL进行检查，反应开始5min后判断：注射部位出现发红，直径超过11mm，45min开始消退，阳性;

5.3 血清学检测

囊性内蚴病的诊断过程较为复杂，难以获得准确的诊断结果，容易漏诊，因此经常采用血清学和免疫学检查方法辅助囊性内蚴病的诊断和鉴定。实验室用于诊断猪囊尾病的方法有：补体结合反应、沉淀反应、间接红细胞凝血试验和酶联免疫吸收试验。互补结合反应长期以来一直用于囊性终球菌病的诊断，但由于假阳性率高，已逐渐被其他方法取代。沉淀反应包括液相沉淀反应和固相沉淀反应，存在检出率过低的缺点，无法通过该方法诊断囊性内蚴病。目前常见的检测方法有间接红细胞凝血试验和酶联免疫吸收试验。

5.3.1 间接红细胞凝血试验

间接红细胞凝血试验（IHAT）是红细胞作为免疫配体的载体和红细胞凝血读数的血清学方法。最常用的红细胞是绵羊红细胞或人（O型）红细胞，它们很容易获得。目前，全部使用醛类红细胞，可以保存半年而不会失去免疫吸收性能。步骤如下：

（1）红细胞鞣制和过敏性醛取红细胞用0.15mol/L PBS（pH7.2）离心洗涤2次，用PBS沉淀2.5%悬浮液;2000年酸溶液（不同批号的钽酸，质量差异必须预先测试以确定适当的浓度）37°C孵育20min，经常摇晃;离心至液体，用PBS洗涤1次，然后用0.15mol/L的PBS（pH6.4）装有10%悬浮液，每次悬浮液均适当稀释抗原液，置于37°C水浴槽中30min（每5分钟振动1次），离心脱液，用PBS洗涤2次（pH7.2），再与1%正常兔血清（NRS）和10%蔗糖缓冲液混合至5%细胞悬浮液。加入0.1%一叠防腐的氮化钠，在4°C下储存或减压冻干备用，已知每批过敏性细胞的血清滴定灵敏度或特异性为阳性和阴性。阳性滴度在1：640以上，阴性血清似乎对可用没有反应。

（2）痕量吸盘试验 在U形（或V形）微槽中，试验血清将用1%NRS或牛血清白蛋白（BSA）生理盐水稀释，比该系列更均匀，稀释血清为每孔0.05mL。向致敏性红细胞悬浮液中每孔加入0.01mL（可校准注射器针滴加），充分振荡和摇动良好，覆盖室温静态1~2h读数结果。

取决于沉积在孔底部的红细胞的类型。"-"，红细胞沉积在管的底部，波点形，光滑的外周，"±"，红细胞沉积在管的底部，周围不光滑或在中心有小白点红细胞具有较小的沉积范围，其中会出现微弱的环;显著阳性检测的最高稀释度是血清的滴定或功效。间接红细胞凝血试验检测脑脊液或血清抗体滴度大于正常参考值的上限，即血清凝血滴定<1：8，脑脊液<1：2，可诊断为脑囊疾病，阳性率为78%~91.4%。

5.3.2 酶联免疫吸收试验

目前，内蚴病最可靠的诊断方法是酶免疫吸附技术。酶联免疫吸收试验（ELISA）的早期建立广泛用于猪的钝病诊断。在此基础上，开发了斑点酶联免疫吸附试验、生物素亲和酶联免疫吸附试验、抑制酶联免疫吸附试验等。此外，还成功开发了利用酶联免疫原理和胶体金断层扫描技术快速诊断囊尾尾病的技术。酶联免疫吸收试验检出率高，特异性强，稳定性好，已列入我国动物检疫程序，具体程序如下：

（ 1 ）将猪的全血片以10cm×1cm的普通过滤条，一端标明猪号，另一端从被测猪的任何部位吸收 1~2 滴血，室内干燥后，置于4°C的冰箱中（可贮存 6 个月）。

（2）将ELISA反应板用抗原包洗涤3次。将抗原通过溶液稀释至工作浓度的抗原并加入到ELISA反应板孔中，每个孔0.1mL，覆盖并置于室温（11至29°C）下过夜。

（3）用力摇动袋，通过隔夜ELISA反应板孔中的抗原包装液，每孔加入洗涤液，浸泡3min，强制抖落洗涤液，并用滤纸除去残留的洗涤液并除去孔中的气泡，重新加入洗涤液，按相同方法共洗涤3次， 即3×3分钟冲洗。

（4）将验血片、标准阴性血片和标准阳性血片切成1cm×1cm大小，分别放入青霉素瓶中，每1cm×1cm血片加稀释0.3mL，浸泡20min，即血片变白后。

（5）每片血片浸出液加2孔，每孔0.1mL。标准阴性、标准阳性对照孔加相应的血板渗滤液2孔，每孔0.1mL。空白控制孔加稀释2孔，每孔0.1mL。加入样品并盖上盖子后，在室温（11至29°C）下放置30min，并按照（2）方法用洗涤液洗涤。

（6）辛辣根过氢酶标记金黄色葡萄球菌蛋白A（HRP-SPA）标准品按说明书稀释至工作浓度。经过测试的孔、标准负孔和标准正孔，每个孔 0.1mL，带 HRP-SPA 标记。空白控制孔也增加了0.1mL。加入盖子后，在室温（11至29°C）下放置30min，并按照（2）方法用洗涤液洗涤。

（7）每个孔加现成的基板溶液0.1mL，室温（11~29°C）放置10min。

（8）每孔加入2滴终止液，终止反应。

（9）确定在建立控制孔的前提下，即标准正孔为深黄色，标准负孔为无色或浅黄色，空白孔为无色，测定试验结果。视觉前判定：与标准负孔相比，颜色比标准负孔深，即猪被判定为ELISA阳性。它也可以通过酶联免疫测定（490nm）测定。使用空白控制孔进行归零可确定检测到的孔的外径值。当OD≤0.22时，判断为ELISA阴性（-），OD≥0.26，判断为ELISA阳性（加），当OD为0.23≤≤0.25时，确定为ELISA疑似（±），对嫌疑人进行一次复试，对嫌疑人仍为阳性。

囊尾抗体检测仅反映寄生虫的存在，而抗原检测可以表明寄生虫在体内存活。理想情况下，测试两者的组合。血清学检测中使用的各种天然抗原来自囊，这些天然抗原也可以用作有用的血清学筛查工具。不同的方法使用不同的可溶性抗原，使测试结果难以比较。囊尾病的检测抗原多为猪囊尾囊液粗抗原或断层扫描纯化抗原，主要包括以下几类：（1）扁豆凝血纯化抗原成分（猪囊尾13ku、14ku 18ku、21ku、24ku、39~42ku或50ku糖蛋白）;(2）囊囊抗原组合物;

在人类或动物感染囊尾后，可以在血清，脑脊液，唾液甚至眼泪中检测到抗体。辐射免疫，血液凝固试验，胶体金，补体结合，酶联免疫反应和免疫打印技术已被用于检测受感染的人或动物囊性内分泌抗体。初始抗原来源于囊、排泄物G分泌物（ES）产物或粗浆，这些未申报的抗原敏感性和特异性较差，容易出现假阳性、假阴性和交叉反应;最佳特异性方法是酶联免疫电转移印记（EITB）技术，最初报道该技术具有100%特异性和98%敏感性。然而，这种方法在诊断大脑中单个囊肿疾病时的敏感性显着降低。Prabhakaran等人报道了一种灵敏的免疫诊断方法（尿素诱导扁豆凝固的三阶段组成）。该方法诊断出60例猪囊尾病患者，其中46%检测出血清中存在抗体，标准免疫印迹诊断方法检测呈阴性。这种商业化的EITB试剂盒可以直接购买，已被广泛用于诊断人和猪的囊尾矿，但该方法也有一定的缺点，如抗原来源无法保证，抗原制备困难，抗原之间存在差异，探针杂交技术昂贵。为了解决这些问题，对这些抗原进行了鉴定、分析和合成，并利用LISA进行了猪囊尾病的诊断试验。ElISA测试显示，这些合成蛋白的特异性和敏感性远低于天然糖蛋白抗原（LLGP）蛋白。Prasad报道了一种用于检测囊性抗原诱导的淋巴细胞增殖的新免疫诊断技术。该技术基于囊性液体抗原，通过淋巴细胞增殖试验测量囊性内球菌刺激体内的细胞免疫反应。研究人员报告说，测试组48名和对照组79名的特异性和敏感性分别为93.8%和96.2%。

检测囊性尾矿的另一种方法是检测抗原。目前，研究人员已经建立了几种检测血清中囊尾藻抗原的检测方法。B158/B60 和 HP10 单克隆抗体已经过验证，并用于囊性内克隆抗原的常规检测，据报道囊性内克隆抗原非常敏感，血清样本为 80%，脑脊液高达 90%。在sactas的流行病学调查中，研究人员计算了B158 / B60和HP10的敏感性和特异性，B158 / B60和HP10的敏感性分别为84%和76%，分别为55%和83%。B158/B60在人尿抗原检测中也具有良好的诊断性能，寄生敏感性为92%（而单囊性终末植菌感染病例数降至62.5%）。只有大多数钙化囊尾矿患者（83%）检测呈阴性。血清和尿液诊断结果的一致性非常好，因此在检测过程中可以用尿液或唾液作为诊断样本代替脑脊液、血清样本，可以大大简化囊性内分泌疾病的筛查过程。