檢測動物源性食物中的寄生蟲 - 棘球蚴病

粒狀棘球縧蟲和多房棘球縧蟲是引起人畜共患寄生蟲病的幼蟲———棘球菌病，也稱為腦病。棘球蚴病是寄生在宿主内髒中間的多種中間部位，壓迫内髒器官引起的寄生器官萎縮，進而引起相應的症狀。成蟲寄生蟲存在于犬類的小腸中，幼蟲可感染多種哺乳動物，牛、羊、豬和駱駝可感染牲畜，牛羊受感染最嚴重，人類也可被感染。該病廣泛分布于世界各地，對人類和動物健康造成嚴重危害，并在流行地區造成嚴重的經濟損失。

1 病原體特征

細粒度棘球縧蟲（單室棘球縧蟲）是一種含有液體的獨立囊狀結構。形狀各不相同，形狀通常因寄生部位而異，大小通常從豌豆到頭部不等。一般近球形，直徑5~10厘米。單室棘球蚴病可分為三類：

（1）人棘球縧蟲囊中含有液體，囊壁由兩層組成：外層較厚，稱為層;毛層可以是長出生毛囊，内壁上的毛囊可以長出一些原來的毛囊，有的毛囊從毛層出來，或者有的頭部部分從毛囊中出來。自由在囊中被稱為"棘輪砂"，肉眼檢查棘輪砂是黃色和白色，如針頭大小。第二代囊，稱為子袋，也可以生長在囊壁毛層上。囊可以在原來的囊（也稱為囊）的腔内生長，稱為"内源性囊"，也可以生長在囊外，稱為"外源囊"。囊的出生層也可以長出太陽囊，囊和囊具有與囊相同的結構，它們的毛層在長長的出生囊上，并形成頭部部分。是以，棘球蚴病囊可能包含許多亞囊和孫子孫女。這種類型在人類中最常見，隻有牲畜中的牛。

（2）絨毛縧病的結構與人類類型基本相似，隻是亞囊和太陽囊不再生長在毛層上。這種類型在綿羊中最為常見。

（3）無頭棘球縧蟲具有與上述類型完全不同的特征，因為囊内沒有毛層，不能生長頭部、下囊和太陽囊。這種類型在牛中最常見。

多室棘球蚴病的特征是囊泡由許多小囊組成，這些囊囊是桑椹狀的。

2 流行病學特征

細粒度棘球蚴病（囊型棘球蚴病，CE）分布于全球，分布于五大洲，牧區數量最多。非洲由肯亞，利比亞，突尼西亞，阿爾及利亞和摩洛哥等國家主導。亞洲的中東地區以阿拉伯聯合酋長國、科威特、沙特阿拉伯、伊拉克和伊朗等國為主，而東地中海的約旦、叙利亞和黎巴嫩等國則是地方性地區。南美洲的疫情更為嚴重，包括阿根廷、巴西、智利、烏拉圭和秘魯等國。北美主要分布在加拿大西北部和阿拉斯加。棘球蚴病存在于大多數歐洲國家，但在西班牙、撒丁島、意大利和法國科西嘉島更為普遍。冰島、塞普勒斯、紐西蘭和澳洲在錫馬尼亞島（Simania）附近早期嚴重流行棘球蚴病，現在通過積極的綜合預防和治療措施，現已基本得到控制。新疆最為嚴重，綿羊感染率在50%~80%，部分地區高達90.85%;中國人類囊炎手術病例數達到每年2000例。近年來，貴州、雲南、東北、河南、山東、河北、安徽、廣西、湖北、湖南等省份均有病例報告。

多室棘球蚴病（氣泡型棘球蚴病，AE）分布區域較為有限，主要分布于整個北半球苔原，特别是在美國阿拉斯加、北海道和西伯利亞，歐洲則發現在法國、德國等國家。中國多室棘球蚴病主要流行于甘肅、甯夏、新疆和青藏高原地區，東北和内蒙古已分發病例報告。

針鼹是一種在犬類和中間宿主之間傳播的疾病，對于狗來說，作為臨終昆蟲，成為針鼹的最終宿主具有重要意義。臨終主人主要是狗，特别是野狗和牧羊犬。雞蛋污染草原和生活環境，導緻牲畜和人類感染。細粒度棘球縧蟲的中間宿主範圍廣泛，流行病學上重要的是感染率最高的綿羊（成年綿羊）。針鼹病的傳播主要在消化道、通過口腔感染兩種方式：一是人體直接與感染的針鼹末端宿主動物頻繁接觸，導緻意外吞咽卵子而感染。流行病學研究表明，棘球蚴病的患病率與人群的習慣有關。某些職業的感染率很高，如牧民（特别是藏族人）、馴鹿飼養者、兒童、學生、乳品勞工、屠宰場人員、制冷廠人員、牲畜毛皮加工或皮革廠勞工、毛紡廠勞工等，無論是血清陽性率還是針鼹病患病率都比較高。長期暴露在人體内感染棘球蚴病的環境中，可以增強機體的免疫力，由于血液中抗體的增加，有利于預防棘球蚴病感染。是以，首次進入流行區後不久感染棘球蚴病的新患者屬于易感人群。另一種方式是間接傳播，其中雞蛋通過污染水源，蔬菜或水果來感染人體。此外，卵子也可以通過呼吸途徑吸入肺部，是以在少數情況下隻有肺部感染而沒有肝髒感染。

3 危害

棘球縧蟲存在于豬、牛、羊等哺乳動物的内髒和肌肉中，對人類和動物造成嚴重傷害。對動物的傷害的嚴重程度主要取決于棘球縧蟲的大小，數量和寄生蟲部位。主要危害是機械壓迫，導緻周圍組織萎縮和功能障礙。此外，多種動物可因囊泡破裂而産生嚴重的過敏反應，猝死，特别是對人的傷害。由于針鼹囊中的針鼹沙子和破碎的毛囊可以在身體的任何部位長成新的棘球縧蟲，而囊囊是人類和動物的同種異體蛋白質，甚至含有毒素，破裂的囊泡會引發人類和牲畜的嚴重過敏反應，導緻呼吸困難，體溫升高， 腹瀉，對人類特别敏感。目前，細粒度棘球蚴病尚無有效的治療方法，主要通過手術切除方法來控制疾病;多室棘球蚴病的生長特征是彌漫性浸泡，形成許多小囊泡，壓迫周圍組織，引起器官萎縮和功能障礙，如惡性惡性良性腫瘤;

4 國内外衛生要求

在檢疫過程中，應将動物器官檢測為針鼹，當在肌肉中發現棘球蚴病時，受影響的部分将被切斷和破壞，其他部位不受限制地使用，但如果嚴重感染和囊泡破裂，受污染的肉胴體，應高溫處理，用于工業用途。

5 檢測方法

5.1 病原體檢測

5.1.1 牲畜檢測

牲畜輕度或初始感染無症狀。綿羊最易患病，受精不良時感染嚴重，毛發倒置，易脫毛，肺部疲憊後連續咳嗽，躺在地上無法站立。當牛肝疲憊、營養不良、反刍動物虛弱、氣脹頻繁、稀疏無力時，肺部是疲憊的咳嗽。當嚴重感染時，生病的動物表現出消瘦，咳嗽，右腹部浮腫。

5.1.2 肉類測試

棘球蚴病主要在肝髒，其次是肺部。肝、肺等受害器官體積明顯增大，表面不均勻，可發現在肝髒、肺，有時在脾髒、腎、腦、皮下、肌肉、骨骼、脊管等其他器官中發現針鼹。切開棘球縧蟲可有液體流出，形成空腔孔，使液體沉澱，用肉眼或解剖鏡下可以看到大量的原始囊和後代囊（即棘輪球砂）;在顯微鏡下用0.1%紅色染色觀察棘球縧蟲的原始頭部部分，可以看到外部或内部頭部部分，以及頂部突出物，小鈎子和吸盤等配件。棘球縧蟲的囊壁由内囊和外糖組成，它們是單細胞核層的生毛膜和無細胞層狀闆結構的層，外膜是纖維膜和被宿主對棘球縧蟲的反應淹沒的發炎細胞。在顯微鏡下，可以觀察到多室針鼹由小囊泡群及其周圍纖維結締組織組成，膜和炎性細胞浸泡，多室針鼹的增殖是内膜芽和旺盛的芽，原頭切片通常很少見。

5.2 血清學檢測

棘球蚴病囊已被用作人囊性囊性囊性囊性疾病原發免疫診斷的主要抗原來源。然而，抗原缺乏敏感性、特異性和标準化困難，特别是在與其他寄生蟲感染者的血清交叉反應方面。雖然重組蛋白是由這些抗原合成的，但迄今為止還沒有标準的高敏感性和特異性測試可用于棘球蚴病的免疫診斷。目前，大多數常用的免疫診斷方法中，大多數透析棘球蚴囊腫為抗原，也用親和層析成像和聚丙烯酰胺凝膠電泳方法增厚和分離抗原，活的或死的原球菌可作為有效的抗原。其中，動物和人可采用皮内過敏反應（Cassoni試驗）診斷，敏感性高，但特異性差，一般準确率在70%左右，但其操作簡單，靈敏度高，能快速測定反應結果，特别适合大規模普查篩查，仍具有實用價值。補體組合試驗的一般陽性率為50%~80%，誤報率很多。棘球蚴病的免疫血清學檢測以間接紅細胞凝血試驗（IHAT）為主，快速簡單，檢出率為83.3%，ELISA具有較高的特異性和敏感性。此外，還有用金黃色葡萄球菌A蛋白标記的酶聯免疫吸收試驗（PPA-ELISA），斑點酶聯免疫吸收試驗（dot-ELISA），生物素親和酶連鎖免疫吸收試驗（ABC-ELISA）。張靜遠等人比較了8種免疫診斷方法，結果顯示ELISA和ABC-ELISA最敏感，其次是IHAT，瓊脂凝膠傳播最差。在酶标記的對流免疫泳中，特異性最高。由于這些測試具有不同水準的假陽性和陰性，是以建議以2至3種方法顯示陽性結果作為疾病的診斷名額。該實驗室目前根據囊腫的成像結構識别技術（超聲、計算機斷層掃描（CT）、X射線）和免疫診斷方法進行診斷，主要是ELISA和免疫印迹，除X射線外，CT檢出率較高。

5.2.1 點聯免疫吸附測定

Dot-ELISA是近年來新開發的一種ELISA技術，采用具有較強吸附能力的硝酸纖維素薄膜作為固相載體，經酶促反應後對底物形成有色沉澱物，使薄膜着色，然後用目視或用光密度掃描器進行定量。Dot-ELISA可用于檢測抗體，也可用于檢測抗原，因為檢測抗原的方法在操作時比其他免疫學檢測更容易，是以目前用于抗原檢測。操作方法如下：

将待測血清以1：1至20稀釋，用微進樣器将1血清滴在硝酸纖維素膜（NC）上，置于70°C下1h的NC膜浸入1%BSA-PBS中，室溫搖動1h，洗滌2次，加入1：1000稀釋的單克隆抗體（McAb）酶标志物， 室溫搖勻2h，洗滌3次，加入底物3'-二氨基苯胺或4氯-1-乙基苯酚，15min，流水終止反應，以目視判斷結果。那些顯示棕色斑點的人是陽性的，否則他們是消極的。産生棕色斑點反應的最高稀釋度是抗原滴度。

免疫印迹

免疫印迹技術（免疫印迹，IB）是由硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳（SDS-PAGE）、電泳轉移和标記免疫測定三種技術相結合的新型免疫探針技術，是分析蛋白質抗原和鑒定生物活性抗原成分的有效方法，近年來已被用于檢測寄生蟲中相應循環抗體組成或分子量抗原的光譜分析 感染宿主液體。它具有高靈敏度和高比特性。用于診斷的免疫印迹技術使用酶标記探針（即二原性及其标記結合），稱為酶聯免疫電轉移印記（EITB）。操作方法如下：

（1）樣品分離 取新鮮棘球菌按照适當比例的緩沖液，順滑，沸水浴2min，離心10000g30min，取備用液體。抗原樣品通過單梳SDS-PAGE電泳分離。左梳孔加标準分子量蛋白，梳孔右側充滿抗原液，電壓控制在160~180V。

（2）電泳轉印 從電泳闆上取出成品電泳凝膠膜，并将其浸入含有轉印緩沖液（TB）的搪瓷闆中。在TB中形成轉印夾芯闆層：取相應大小的NC膜，慢慢浸泡在TB中，凝膠膜與NC膜有光澤合攏。然後在凝膠和NC膜的兩面放置兩層濕濾紙，然後用海綿墊（厚度0.5~1cm）一層，做好定向标記，最後夾在兩層穿孔塑膠襯裡之間，絕對避免層間出現氣泡。将TB倒入轉印槽并插入轉印闆，使凝膠位于陰極側，NC膜位于陽極側。傳輸槽位于冰箱中，溫度為4度，通電數小時或過夜，電流控制在250mA左右（40至50V）。

（3）探針檢測 取出轉印的NC膜，水準放入湮滅劑中，室溫下搖動1h，關閉未吸收蛋白質的區域，然後用洗滌緩沖液洗滌2~3次，每次30min除去變性劑，使蛋白質的自然狀态和生物特性得以恢複。将平片NC膜浸入Tris緩沖液（TBS）濾紙中，用刀片将NC膜沿電泳方向劈成約0.5厘米寬的直條，用鉛筆标記上端。取其中一條條，用标準蛋白質條帶進行氨基黑染色（也可用于Coomas亮藍色染色或銀染色），以測試分離效果并确定分子量位置。将剩餘的條帶幹燥，然後留下進行列印測試（抗原活性可以保持3個月以上）。

（4）壓印試驗将上述抗原條置于格栅反應闆的反應槽中，面朝上，每個槽一個，用0.05%TBS-T-T液體預浸泡;通常需要0.5~1.5mL，相當于10 sL血樣（每罐相同量的液體），室溫（20~25°C）振蕩60min，TBS-T洗滌6次，每次3min，用稀釋的羊抗人酶标志物粘結劑，孵育1.5h，如上所述洗滌，加入新鮮配制的底物溶液，15min後用蒸餾水沖洗數次，終止反應， 從玻璃闆上取出薄膜條自然幹燥，正藍黑色（4-氯-1-萘酚基材）或棕褐色二氨基苯基聯苯胺（DAB）條。