检测动物源性食物中的寄生虫 - 棘球蚴病

粒状棘球绦虫和多房棘球绦虫是引起人畜共患寄生虫病的幼虫———棘球菌病，也称为脑病。棘球蚴病是寄生在宿主内脏中间的多种中间部位，压迫内脏器官引起的寄生器官萎缩，从而引起相应的症状。成虫寄生虫存在于犬类的小肠中，幼虫可感染多种哺乳动物，牛、羊、猪和骆驼可感染牲畜，牛羊受感染最严重，人类也可被感染。该病广泛分布于世界各地，对人类和动物健康造成严重危害，并在流行地区造成严重的经济损失。

1 病原体特征

细粒度棘球绦虫（单室棘球绦虫）是一种含有液体的独立囊状结构。形状各不相同，形状通常因寄生部位而异，大小通常从豌豆到头部不等。一般近球形，直径5~10厘米。单室棘球蚴病可分为三类：

（1）人棘球绦虫囊中含有液体，囊壁由两层组成：外层较厚，称为层;毛层可以是长出生毛囊，内壁上的毛囊可以长出一些原来的毛囊，有的毛囊从毛层出来，或者有的头部部分从毛囊中出来。自由在囊中被称为"棘轮砂"，肉眼检查棘轮砂是黄色和白色，如针头大小。第二代囊，称为子袋，也可以生长在囊壁毛层上。囊可以在原来的囊（也称为囊）的腔内生长，称为"内源性囊"，也可以生长在囊外，称为"外源囊"。囊的出生层也可以长出太阳囊，囊和囊具有与囊相同的结构，它们的毛层在长长的出生囊上，并形成头部部分。因此，棘球蚴病囊可能包含许多亚囊和孙子孙女。这种类型在人类中最常见，只有牲畜中的牛。

（2）绒毛绦病的结构与人类类型基本相似，只是亚囊和太阳囊不再生长在毛层上。这种类型在绵羊中最为常见。

（3）无头棘球绦虫具有与上述类型完全不同的特征，因为囊内没有毛层，不能生长头部、下囊和太阳囊。这种类型在牛中最常见。

多室棘球蚴病的特征是囊泡由许多小囊组成，这些囊囊是桑椹状的。

2 流行病学特征

细粒度棘球蚴病（囊型棘球蚴病，CE）分布于全球，分布于五大洲，牧区数量最多。非洲由肯尼亚，利比亚，突尼斯，阿尔及利亚和摩洛哥等国家主导。亚洲的中东地区以阿拉伯联合酋长国、科威特、沙特阿拉伯、伊拉克和伊朗等国为主，而东地中海的约旦、叙利亚和黎巴嫩等国则是地方性地区。南美洲的疫情更为严重，包括阿根廷、巴西、智利、乌拉圭和秘鲁等国。北美主要分布在加拿大西北部和阿拉斯加。棘球蚴病存在于大多数欧洲国家，但在西班牙、撒丁岛、意大利和法国科西嘉岛更为普遍。冰岛、塞浦路斯、新西兰和澳大利亚在锡马尼亚岛（Simania）附近早期严重流行棘球蚴病，现在通过积极的综合预防和治疗措施，现已基本得到控制。新疆最为严重，绵羊感染率在50%~80%，部分地区高达90.85%;中国人类囊炎手术病例数达到每年2000例。近年来，贵州、云南、东北、河南、山东、河北、安徽、广西、湖北、湖南等省份均有病例报告。

多室棘球蚴病（气泡型棘球蚴病，AE）分布区域较为有限，主要分布于整个北半球苔原，特别是在美国阿拉斯加、北海道和西伯利亚，欧洲则发现在法国、德国等国家。中国多室棘球蚴病主要流行于甘肃、宁夏、新疆和青藏高原地区，东北和内蒙古已分发病例报告。

针鼹是一种在犬类和中间宿主之间传播的疾病，对于狗来说，作为临终昆虫，成为针鼹的最终宿主具有重要意义。临终主人主要是狗，特别是野狗和牧羊犬。鸡蛋污染草原和生活环境，导致牲畜和人类感染。细粒度棘球绦虫的中间宿主范围广泛，流行病学上重要的是感染率最高的绵羊（成年绵羊）。针鼹病的传播主要在消化道、通过口腔感染两种方式：一是人体直接与感染的针鼹末端宿主动物频繁接触，导致意外吞咽卵子而感染。流行病学研究表明，棘球蚴病的患病率与人群的习惯有关。某些职业的感染率很高，如牧民（特别是藏族人）、驯鹿饲养者、儿童、学生、乳品工人、屠宰场人员、制冷厂人员、牲畜毛皮加工或皮革厂工人、毛纺厂工人等，无论是血清阳性率还是针鼹病患病率都比较高。长期暴露在人体内感染棘球蚴病的环境中，可以增强机体的免疫力，由于血液中抗体的增加，有利于预防棘球蚴病感染。因此，首次进入流行区后不久感染棘球蚴病的新患者属于易感人群。另一种方式是间接传播，其中鸡蛋通过污染水源，蔬菜或水果来感染人体。此外，卵子也可以通过呼吸途径吸入肺部，因此在少数情况下只有肺部感染而没有肝脏感染。

3 危害

棘球绦虫存在于猪、牛、羊等哺乳动物的内脏和肌肉中，对人类和动物造成严重伤害。对动物的伤害的严重程度主要取决于棘球绦虫的大小，数量和寄生虫部位。主要危害是机械压迫，导致周围组织萎缩和功能障碍。此外，多种动物可因囊泡破裂而产生严重的过敏反应，猝死，特别是对人的伤害。由于针鼹囊中的针鼹沙子和破碎的毛囊可以在身体的任何部位长成新的棘球绦虫，而囊囊是人类和动物的同种异体蛋白质，甚至含有毒素，破裂的囊泡会引发人类和牲畜的严重过敏反应，导致呼吸困难，体温升高， 腹泻，对人类特别敏感。目前，细粒度棘球蚴病尚无有效的治疗方法，主要通过手术切除方法来控制疾病;多室棘球蚴病的生长特征是弥漫性浸泡，形成许多小囊泡，压迫周围组织，引起器官萎缩和功能障碍，如恶性肿瘤;

4 国内外卫生要求

在检疫过程中，应将动物器官检测为针鼹，当在肌肉中发现棘球蚴病时，受影响的部分将被切断和破坏，其他部位不受限制地使用，但如果严重感染和囊泡破裂，受污染的肉胴体，应高温处理，用于工业用途。

5 检测方法

5.1 病原体检测

5.1.1 牲畜检测

牲畜轻度或初始感染无症状。绵羊最易患病，受精不良时感染严重，毛发倒置，易脱毛，肺部疲惫后连续咳嗽，躺在地上无法站立。当牛肝疲惫、营养不良、反刍动物虚弱、气胀频繁、稀疏无力时，肺部是疲惫的咳嗽。当严重感染时，生病的动物表现出消瘦，咳嗽，右腹部浮肿。

5.1.2 肉类测试

棘球蚴病主要在肝脏，其次是肺部。肝、肺等受害器官体积明显增大，表面不均匀，可发现在肝脏、肺，有时在脾脏、肾、脑、皮下、肌肉、骨骼、脊管等其他器官中发现针鼹。切开棘球绦虫可有液体流出，形成空腔孔，使液体沉淀，用肉眼或解剖镜下可以看到大量的原始囊和后代囊（即棘轮球砂）;在显微镜下用0.1%红色染色观察棘球绦虫的原始头部部分，可以看到外部或内部头部部分，以及顶部突出物，小钩子和吸盘等配件。棘球绦虫的囊壁由内囊和外糖组成，它们是单细胞核层的生毛膜和无细胞层状板结构的层，外膜是纤维膜和被宿主对棘球绦虫的反应淹没的炎症细胞。在显微镜下，可以观察到多室针鼹由小囊泡群及其周围纤维结缔组织组成，膜和炎性细胞浸泡，多室针鼹的增殖是内膜芽和旺盛的芽，原头切片通常很少见。

5.2 血清学检测

棘球蚴病囊已被用作人囊性囊性囊性囊性疾病原发免疫诊断的主要抗原来源。然而，抗原缺乏敏感性、特异性和标准化困难，特别是在与其他寄生虫感染者的血清交叉反应方面。虽然重组蛋白是由这些抗原合成的，但迄今为止还没有标准的高敏感性和特异性测试可用于棘球蚴病的免疫诊断。目前，大多数常用的免疫诊断方法中，大多数透析棘球蚴囊肿为抗原，也用亲和层析成像和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法增厚和分离抗原，活的或死的原球菌可作为有效的抗原。其中，动物和人可采用皮内过敏反应（Cassoni试验）诊断，敏感性高，但特异性差，一般准确率在70%左右，但其操作简单，灵敏度高，能快速测定反应结果，特别适合大规模普查筛查，仍具有实用价值。补体组合试验的一般阳性率为50%~80%，误报率很多。棘球蚴病的免疫血清学检测以间接红细胞凝血试验（IHAT）为主，快速简单，检出率为83.3%，ELISA具有较高的特异性和敏感性。此外，还有用金黄色葡萄球菌A蛋白标记的酶联免疫吸收试验（PPA-ELISA），斑点酶联免疫吸收试验（dot-ELISA），生物素亲和酶连锁免疫吸收试验（ABC-ELISA）。张静远等人比较了8种免疫诊断方法，结果显示ELISA和ABC-ELISA最敏感，其次是IHAT，琼脂凝胶传播最差。在酶标记的对流免疫泳中，特异性最高。由于这些测试具有不同水平的假阳性和阴性，因此建议以2至3种方法显示阳性结果作为疾病的诊断指标。该实验室目前根据囊肿的成像结构识别技术（超声、计算机断层扫描（CT）、X射线）和免疫诊断方法进行诊断，主要是ELISA和免疫印迹，除X射线外，CT检出率较高。

5.2.1 点联免疫吸附测定

Dot-ELISA是近年来新开发的一种ELISA技术，采用具有较强吸附能力的硝酸纤维素薄膜作为固相载体，经酶促反应后对底物形成有色沉淀物，使薄膜着色，然后用目视或用光密度扫描仪进行定量。Dot-ELISA可用于检测抗体，也可用于检测抗原，因为检测抗原的方法在操作时比其他免疫学检测更容易，因此目前用于抗原检测。操作方法如下：

将待测血清以1：1至20稀释，用微进样器将1血清滴在硝酸纤维素膜（NC）上，置于70°C下1h的NC膜浸入1%BSA-PBS中，室温摇动1h，洗涤2次，加入1：1000稀释的单克隆抗体（McAb）酶标志物， 室温摇匀2h，洗涤3次，加入底物3'-二氨基苯胺或4氯-1-乙基苯酚，15min，流水终止反应，以目视判断结果。那些显示棕色斑点的人是阳性的，否则他们是消极的。产生棕色斑点反应的最高稀释度是抗原滴度。

免疫印迹

免疫印迹技术（免疫印迹，IB）是由硫酸钠聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）、电泳转移和标记免疫测定三种技术相结合的新型免疫探针技术，是分析蛋白质抗原和鉴定生物活性抗原成分的有效方法，近年来已被用于检测寄生虫中相应循环抗体组成或分子量抗原的光谱分析 感染宿主液体。它具有高灵敏度和高比特性。用于诊断的免疫印迹技术使用酶标记探针（即二原性及其标记结合），称为酶联免疫电转移印记（EITB）。操作方法如下：

（1）样品分离 取新鲜棘球菌按照适当比例的缓冲液，顺滑，沸水浴2min，离心10000g30min，取备用液体。抗原样品通过单梳SDS-PAGE电泳分离。左梳孔加标准分子量蛋白，梳孔右侧充满抗原液，电压控制在160~180V。

（2）电泳转印 从电泳板上取出成品电泳凝胶膜，并将其浸入含有转印缓冲液（TB）的搪瓷板中。在TB中形成转印夹芯板层：取相应大小的NC膜，慢慢浸泡在TB中，凝胶膜与NC膜有光泽合拢。然后在凝胶和NC膜的两面放置两层湿滤纸，然后用海绵垫（厚度0.5~1cm）一层，做好定向标记，最后夹在两层穿孔塑料衬里之间，绝对避免层间出现气泡。将TB倒入转印槽并插入转印板，使凝胶位于阴极侧，NC膜位于阳极侧。传输槽位于冰箱中，温度为4度，通电数小时或过夜，电流控制在250mA左右（40至50V）。

（3）探针检测 取出转印的NC膜，水平放入湮灭剂中，室温下摇动1h，关闭未吸收蛋白质的区域，然后用洗涤缓冲液洗涤2~3次，每次30min除去变性剂，使蛋白质的自然状态和生物特性得以恢复。将平片NC膜浸入Tris缓冲液（TBS）滤纸中，用刀片将NC膜沿电泳方向劈成约0.5厘米宽的直条，用铅笔标记上端。取其中一条条，用标准蛋白质条带进行氨基黑染色（也可用于Coomas亮蓝色染色或银染色），以测试分离效果并确定分子量位置。将剩余的条带干燥，然后留下进行打印测试（抗原活性可以保持3个月以上）。

（4）压印试验将上述抗原条置于格栅反应板的反应槽中，面朝上，每个槽一个，用0.05%TBS-T-T液体预浸泡;通常需要0.5~1.5mL，相当于10 sL血样（每罐相同量的液体），室温（20~25°C）振荡60min，TBS-T洗涤6次，每次3min，用稀释的羊抗人酶标志物粘结剂，孵育1.5h，如上所述洗涤，加入新鲜配制的底物溶液，15min后用蒸馏水冲洗数次，终止反应， 从玻璃板上取出薄膜条自然干燥，正蓝黑色（4-氯-1-萘酚基材）或棕褐色二氨基苯基联苯胺（DAB）条。