檢測動物源性食物中的寄生蟲 - 弓形蟲病

弓形蟲病是一種專門的細胞内寄生蟲，沒有特定的宿主，幾乎所有的動物，包括人體内的各種核細胞都可以被感染，人和動物的感染率都非常高。當弓形蟲病（弓形蟲病）在豬群中爆發時，可導緻整個養豬場發病，死亡率超過60%，造成巨大的經濟損失，嚴重影響水産養殖業的發展。豬弓形蟲病與公衆健康息息相關，豬肉是人們生活中最重要的動物源性食品，弓形蟲病感染豬及其肉制品是人類感染弓形蟲病的重要來源，對人體健康構成巨大威脅。

1 病原體特征

病原體弓形蟲病于1908年由Nicolle和Manceaux在北非突尼西亞的齧齒動物腳趾大鼠中發現，并正式命名。弓形蟲，T.gondii或弓形蟲，屬于Apicomplexa，孢子（Sporozoasida），Eucocciida，Sarcocystidae和弓形蟲屬。目前，大多數學者認為弓形蟲病隻有一種，即血清型，但存在不同的菌株。

弓形蟲病的有性繁殖發生在宿主貓末期小腸的上皮細胞中，無性繁殖發生在中間宿主溫血動物的核細胞中，除紅細胞外。弓形蟲病發展的全過程一般包括滋養體（又稱快速增殖）、囊、裂解、配體和卵囊5種形式，分别在中間宿主和臨終宿主中。增殖器呈弓形、月牙形或香蕉形，一端指向，另一端為鈍圓，平均大小為（4至7）×（2至4）米。卵囊存在于貓中，大小為橢圓形（11至14）米×（7至11）米。囊是圓形或橢圓形的，直徑為5至100米。

貓吞下弓形蟲病的囊或卵巢囊，蠕蟲被釋放，部分淋巴和血液循環被帶到全身的器官群組織，侵入核細胞，而另一部分昆蟲在小腸上皮細胞中進行球狀發育的裂解和兒子的繁殖，産生卵囊。囊與糞便一起排洩，并在外部發育成傳染性孢子基囊。中間宿主吃或喝被孢子基卵囊污染的食物和水後，孢子基囊釋放孢子，通過淋巴和血液進入組織器官，并侵入核細胞形成感染。如果感染的菌株非常強，并且宿主不能産生足夠的免疫力，則可引起弓形蟲病的急性爆發;

2 流行病學特征

弓形蟲病是一種世界性的人畜共患疾病，在動物和人類以及至少200種哺乳動物中都有感染。感染的主要來源是患者，患病動物和有昆蟲的動物，包括血液，肉類，内髒等，可能患有弓形蟲病。分泌物如牛奶，唾液，痰液，尿液和鼻子含有弓形蟲病;感染率不是嚴格意義上的區域性和季節性的，但秋冬季節和早春的發病率最高，這可能與動物身體的抵抗力有關。全球每年約有10億人感染弓形蟲病，感染率與當地居民的文化和飲食習慣有關，國外人口感染率為0.6%~94%，平均為25%~58%，其中歐美弓形蟲病感染率較高， 法國是地方病最嚴重的國家，感染率從80%到90%不等，荷蘭的感染率較高，為40%，非洲和拉丁美洲的感染率較高，東南亞、北美和大洋洲的感染率較低。在中國發現弓形蟲病在亞洲還為時過早。新中國成立前，中國沒有甲蟲病的報道。1964年，謝天華首次報道江西人弓形蟲病。我國幾乎每個省份都有人形蟲病報告，感染率為0.09%~34%，平均感染率為7.88%，各年齡段人群均可感染，少數民族地區的感染率可能更高，雖然我國人口弓形蟲病感染率低于世界平均水準，但呈現出逐年上升的趨勢。

弓形蟲病在家畜、豬、羊、牛、馬等中普遍可感染，對豬危害最大，國外報道，該病發生在3~4個月大的仔豬身上，其症狀與豬瘟相似，其病死率可高達30%~40%，其中豬病的緻死率最高， 而成年豬的發病率較低，大多隐患或症狀輕微。1955年，于恩軒等人在福建首次從貓、豬等動物身上分離出弓形蟲病，1977年吳淑賢在上海首次從"無名高燒"豬體内分離出弓形蟲病，證明了我國豬中弓形蟲病的爆發。我國豬弓形蟲病感染率為4%~71.4%，不同品種、不同年齡、不同性别的豬可患病，7~9個月發病較多，育肥豬發病率最高，25公斤以上，豬月齡對感染率不規律，性别差異較大， 母豬感染率為36.4%，公豬感染率為29.4%，按流行形式可分為暴發型、急性型、散發性分布型和隐性感染。

弓形蟲病感染在中國其他動物中也很常見，貓感染率為15%~73%，狗感染率為3%~33%，綿羊感染率為10%~50%，牛感染率為0.2%~43.3%。家禽也感染了弓形蟲病，雞、鴨和鵝的感染率分别為15.69%、3.84%和16.54%。

3 危害

免疫力正常的人通常感染弓形蟲病，通常沒有明顯的臨床症狀，一旦機體免疫力下降或免疫缺陷被感染，可引起全身反應和多器官損傷，嚴重死亡。妊娠期感染弓形蟲病可引起流産、早産、死産，弓形蟲病可通過胎盤感染胎兒，引起胎兒先天性感染。出生後，胎兒表現為一系列中樞神經系統症狀和對眼睛和内髒器官的先天性損傷。有些新生兒出生時沒有特殊體征，隻有體重輕、貧血、黃疸等，但逐漸出現抽搐、腦膜炎和癫痫等神經系統病變，可引起智力發育障礙。

感染弓形蟲病的動物生長緩慢，飼料使用率下降，生産性能低，長期與蟲害同害，死亡嚴重;其中最有害的是豬。目前，我國豬中弓形蟲病分布十分廣泛，華北、華東、東北、華中、華南、西南、西北等地區均有該病發生率報告，感染率和死亡率普遍較高。豬肉是人們生活中最重要的動物源性食品，感染弓形蟲病的豬及其肉制品對人體健康構成巨大威脅。感染弓形蟲病的豬通常沒有明顯的臨床症狀，但實際上隐性感染豬的組織可能含有弓形蟲病袋，如果處理不當或由于個人習慣（如未煮熟或生肉）可能導緻人弓形蟲病感染。

Mendonca等人使用PCR技術擴增處理的豬肉香腸樣品，同時在小鼠血清中測試處理過的豬肉香腸樣品，并在小鼠血清中測試IFA特異性抗弓形蟲病抗體，導緻PCR檢測率為47.14%（33/70），小鼠血清為陰性，盡管結果顯示豬肉香腸樣品不含活弓形蟲病， 但高PCR檢出率也表明，豬肉香腸受弓形蟲病污染更為嚴重。如果香腸在加工過程中的鹽濃度<3.0%，鹽<3d，則不會有效地殺死香腸中的弓形蟲袋或快速繁殖者。1997年在南韓爆發的兩次疫情導緻共有8人因食用未加熱（野生）豬的脾髒和肝髒而患上食源性急性弓形蟲病。Dias等人調查了巴西Lundrina市的47家屠宰勞工血清和149家（8家制造商）的新鮮豬肉香腸進行小鼠生物學測試，發現血清陽性率分别為59.6%（28/47）和8.7%（13/149），發現新鮮豬肉香腸在弓形蟲病的傳播中起重要作用。

4 診斷技術

根據臨床症狀、病理變化和流行病學作出初步診斷，必須在實驗室中鑒定出病原體或特異性抗體的診斷，主要方法有病原體檢查、血清學檢測和分子生物學診斷。

4.1 病原體檢查

4.1.1 直接塗片

取血液、血清、腹水或肝髒、肺、淋巴結等疾病材料直接塗抹Jimsa或Rhys染料染色，鏡面檢查，發現蟲體可診斷。該方法在診斷弓形蟲病方面非常準确，但檢出率低，容易漏檢。

4.1.2 組織切片染色方法

冷凍切片的病組織，用免疫酶或熒光染色，不僅可以使袋着色，還可以使分散的弓形蟲病和感染的昆蟲體内的細胞着色，這種方法靈敏度高，特異性強，可以提高蟲體的檢出率。

4.1.3 動物接種分離和細胞培養

将肝、肺、淋巴結等疾病物質均質化後，加入5~10倍生理鹽水混合、過濾、離心，取小鼠腹腔液，觀察發病情況，可百葉盲幾代，提高檢出率。這種方法具有高度敏感性和特異性，但非常耗時。上述疾病材料也可以接種在單層核細胞中，從體外培養，細胞培養相比動物接種，靈敏度較低，但所需時間短。

4.1.4 卵囊檢查方法

将糞便用飽和氯化鈉或蔗糖溶液（30%）漂浮以收集卵囊性檢查，但檢出率普遍較低。

4.2 血清學檢測

血清學檢測因其快速、準确、經濟，已成為檢測弓形蟲病感染的一種廣泛應用和快速發展的方法。主要方法有：染色試驗、間接紅細胞凝血試驗、ELISA、間接免疫熒光試驗、補體結合試驗和免疫膠體金技術。

4.2.1 染色試驗

弓形蟲快速增殖劑、補體輔因子和待檢測血清一起在37°C下孵育1h，然後用線粒體藍染色，當特異性抗體存在時，寄生膜通透性增加，細胞質流出，快速增殖劑不能與染料結合而顯示無色;該方法是弓形蟲病的經典血清學檢查，具有良好的特異性，敏感性和可重複性。然而，該方法極其危險，因為它必須在檢查中使用活的，有毒的快速繁殖的兒子，并且其應用受到限制。

間接紅細胞凝血試驗

增殖物的可溶性抗原吸附到紅細胞表面，然後與相應的抗體反應，使紅細胞通過抗原和抗體的特異性反應間接凝結。Jacob和Lund于1957年首次将該方法應用于弓形蟲病檢測。1979年，中國餘恩軒将IHAT應用于豬的弓形蟲病檢測。1982年，中國農業科學院蘭州獸醫研究所研制出IHAT診斷試劑盒。Wilson和其他人使用ELISA，IHAT和IFAT試劑盒測試了100個血清樣本，并得出結論，IHAT對急性感染的早期血清不敏感。崔兆軍等人認為，IHAT特異性高，假陽性率低，診斷值高，操作簡單，缺點不如ELISA敏感，重複性少，過敏性紅細胞不穩定，陽性判斷标準具有一定的主觀性。

4.2.3 酶聯免疫吸附測定

用酶闆包裹快速增殖的可溶性抗原，加入待測血清，再滴下酶标記的兩種抗性（如辛辣根過氧化物酶标記的抗羊IgG），利用酶的催化作用和底物擴增反應原理，對試驗抗體進行定性和定量分析。1976年，Voller等人首次應用該方法檢測弓形蟲病特異性抗原，獲得良好的DT和IHAT依從率，靈敏度強。Peter等人利用弓形杆菌病大腸菌群粗抗原建立間接ELISA檢測豬弓形蟲病，并與DT法比較，間接ELISA的敏感性和特異性為94%。

近年來，随着分子生物學技術的應用，重組抗原取代天然抗原作為診斷抗原，消除了抗原制備過程的繁瑣，進而達到經濟、特殊和安全的目的。Redlich等人建立了ELISA與表達的融合蛋白GRA6-GST，其敏感性為98%，而Aubert等人混合重組杆蛋白1（ROP1），表面抗原蛋白（P25和P35）建立了ELISA用于檢測弓形蟲病IgM，其敏感性分别為93.1%，95.0%和94.5%，分别用于弓形蟲病的早期診斷Huang等人建立了具有表面蛋白P22（SAG2）的ELISA， 與IHAT相比，發現該方法具有高度特異性和敏感性。國内陸斌等人用重組P35-GST建立了檢測人血清IgM ELISA的方法，該方法可以區分弓形蟲病急性感染和慢性感染。張東林等人建立了AG-ELISA，可以檢測多種動物弓形蟲病抗體，并在四種人工感染豬和自然感染動物（豬、牛、貓和狗）的血清中檢測到抗弓形蟲病抗體，表明AG-ELISA陽性檢測時間早于改進的凝血試驗方法，且檢測率較高， 靈敏度和準确性均優于乳膠凝試驗。

總之，該方法易于自動化，具有高度的特異性和靈敏度，結果可量化，适用于批量樣品檢測，具有良好的推廣和應用價值。

間接熒光抗體試驗

将抗原用作快速增殖劑，與稀釋的血清孵育，加入熒光素（異糖氰酸酯熒光素）标記物的二原，并在熒光顯微鏡下觀察結果。Miller等人對28例陽性和46例陰性患者的血清進行了檢測，發現其敏感性和特異性分别為96.4%和67.3%。該方法用于弓形蟲病早期感染的IgM和IgG抗體檢測，具有靈敏度高、特異性和重制性高等優點，但類風濕因子可引起IgM抗體假陽性反應。該方法的廣泛使用受到測試中熒光顯微鏡觀察需求的限制。

4.2.5 免疫膠體金技術（ICT）

ICT是一種新型的免疫标記技術，應用于以膠體金為示蹤标記的抗原抗體。王豔華等人設定了IC檢測弓形蟲病血清，與IHAT相比，結果依從率為82.5%，ICT比IHAT能夠提前2d檢測出弓形蟲病抗體，說明ICT的靈敏度高于IHAT。日本廣元大學重組SAG2抗原，建立快速免疫學檢測，檢測貓體内剛性弓形蟲病抗體。結果表明，ICT是一種快速、簡單、靈敏（敏感性可達到ELISA水準）且具有特異性，适用于弓形蟲病特異性抗體的現場診斷的有效工具。

4.2.6 乳膠凝固試驗

以乳膠顆粒為載體的凝膠反應中，于恩軒等人指出，LAT用于檢測弓形蟲病感染的初始敏感性。陳亞軒等人認為，LAT具有操作簡單、采集量低、結果穩定、易于觀察等優點，适用于大規模血清流行病學調查。倫敦公共衛生實驗室使用LAT作為正常篩查測試，假陽性率為1%至2%。蔣濤利用重組弓形蟲病微線蛋白3的乳膠凝集試驗（rMIC3-LAT）檢測人工感染弓形蟲病試驗豬血清特異性抗體的動态變化，與IHAT和ELISA相比，發現LAT靈敏度高于IHAT，檢測抗體的時間早于ELISA，時間範圍更廣。

總之，LAT具有特異性強、靈敏度高、重複性好、操作簡單、結果判斷容易等特點，既可用于早期診斷，也可用于抗體監測，适用于現場檢測和大規模血清流行病學調查。但是，判斷中存在一些主觀因素，不能做定量分析。

4.2.7 補體結合試驗

Nicolan和Rovello首先使用該測試來診斷弓形蟲病。Ondriska等人認為它是弓形蟲病感染的可靠名額，特别是在測試單個樣本時，如果CFT與IgM或IgA抗體水準或親和力IgG抗體水準相結合，它可以更客觀地反映疾病的程序。該測試不适合某些動物，如牛和山羊。

分子生物學診斷

目前，國内外已經建立了多種弓形蟲病的基因診斷方法，主要是PCR和DNA探針技術，具有操作簡單、速度快、特異性強、靈敏度強等優點。

4.3.1 聚合酶鍊反應

PCR檢測中使用的靶基因為B1基因、P30（SAG1）基因、ITS1、rDNA（18S rRNA和5.8S rRNA）和529bp重複序列。B1基因是一種多拷貝基因，且序列高度保守，是目前最理想的檢測基因。Burg等于1989年PCR的第一個B1基因作為靶基因，目前僅從細胞裂解物中成功檢測到1個弓形蟲病，李健等人選擇B1基因作為靶基因，pcR檢測全血DNA與ELISA檢測血清IgM相比，PCR陽性的最早檢測時間早于ELISA， 可用于弓形蟲病的早期診斷。Shedward等人建立了一種獨特的弓形蟲病PCR診斷方法，具有弓形蟲病DNA的第一轉錄間隔區（ITS1）序列，可以檢測多達10個弓形蟲病快速定植者的DNA，并且與8個相關的原生動物和線蟲沒有交叉反應。于力等人采用529bp重複序列作為靶基因，建立了豬肉PCR檢測方法，每10g豬肉可檢測100個快速增殖，而B1基因每10g豬肉可檢測1000個快速增殖，其靈敏度是B1基因的10倍。

為了提高實驗的靈敏度和特異性，在普通PCR的基礎上，開發了巢式PCR，集PCR、RT-PCR等。Johnson等人設計了兩對基于SAG1基因的引物，首先用DS29和DS30引物對擴增，然後用DS38和DS39引物對進行第二次擴增，其靈敏度可以達到0.05pg的弓形蟲病DNA。陳曉光等人設定了巢型PCR，最低可檢測1pg的弓形蟲病DNA，Sawa等巢型PCR檢測到0.05pg的P30 DNA，理論上相當于基因組DNA的快速增殖器、Ana Hurtado等單管套管PCR檢測方法，結果與IFAT結果基本相同， 和0.1pg弓形蟲病RH菌株DNA的敏感性。

4.3.2 環介導等溫放大（LAMP）

LAMP是Notomi在2000年報道的一種新的核酸擴增技術，它用BstDNA聚合酶鍊的自動循環取代了DNA經典合成。LAMP隻需要在相同的溫度下（63~65°C），30~60min即可合成10~20μg的DNA，與PCR相比，不需要染色，肉眼即可觀察到結果。楊秋林等人根據弓形蟲病特異性基因B1的基因序列，設計了一套LAMP特異性引物，實驗表現出更好的特異性和敏感性。Zhang等人設計的LAMP引物具有高度保守的重複序列529bp，伴有弓形蟲病，敏感性為85.7%，而PCR敏感性為76.9%。Krasteva等人利用弓形蟲病單拷貝基因SAG1設計了弓形蟲病DNA的LAMP引物擴增，其比PCR更靈敏。Sotiriadou等人用燈放大弓形蟲病B1和OWP基因來檢測水弓形蟲病，可以檢測出0.1個快速增殖物。

4.3.3 DNA探針

Blanco等人已經建立了RH菌株弓形蟲病基因庫，篩選出重複片段，使用32P标記作為探針，并斑點雜交檢測到超過80pg的純化弓形蟲病DNA。Xia Aiyu等人還建立了弓形蟲病基因庫（ZS-2）菌株，篩選了1.1kb特異性DNA片段，并使用32P标記作為探針檢測弓形蟲病，靈敏度為500 pg純化的弓形蟲病DNA。Angel等人使用APGTg7标記的探針雜交在急性弓形蟲病性腦炎患者中測試DNA，靈敏度為66.7%。目前，用于弓形蟲病檢測的大多數探針都是特異性DNA克隆片段或合成寡核苷酸探針，雖然靈敏度高，但其制備需要一定條件，且成本高，不易推廣。

分子生物學診斷是一種非常敏感和具體的方法，但它對實驗環境和操作人員的技術要求很高，影響其結果的因素很多，成本高，不利于普及。在實踐中，血清學檢測是主要關注點。