CRISPR-Cas12a是Type V-A型CRISPR-Cas核酸酶成員,目前LbCas12a、AsCas12a、FnCas12a、Mb2Cs12a等又被應用于植物基因組編輯中(Tang et al., 2017; Zhong et al., 2018; Zhang et al., 2021; Jiao et al., 2023; Hui et al., 2024),其中基于LbCas12a的植物基因組編輯工具在多基因敲除編輯、非編碼RNA編輯、啟動子調控區編輯等研究中顯示了明顯優勢(Tang et al., 2017; Tang et al., 2019; Tang and Zhang, 2023; Zhou et al., 2023),為植物功能基因解析及分子育種提供了有效工具.但LbCas12a一方面需要識别“5-TTTV-3”的4堿基PAM基序,一方面室溫活性相對較低(Malzahn et al., 2019),限制了其在重要農作物中的應用範圍.同時,相較自然界中廣泛存在的Type V-A型CRISPR-Cas12a分子資源,目前可以有效作為植物基因組編輯工具的Cas12a同系物仍然鑒定、開發有限.近日,Plant Biotechnology Journal線上發表了由西南大學/電子科技大學張勇教授及其合作團隊撰寫的“PAM‐relaxed and temperature‐tolerant CRISPR‐Mb3Cas12a single transcript unit systems for efficient singular and multiplexed genome editing in rice, maize, and tomato”研究論文.
該研究在對比測試了源于Helcococcus kunzii、Moraxella bovoculi、Pseudobutyrivibrio ruminis的CRISPR-HkCas12a、CRISPR-Mb3Cas12a, CRISPR-PrCas12a編輯活性及特性基礎上,針對其中識别5’-TTV-3’簡單PAM基序的Mb3Cas12a進行系統性工作,通過優化Mb3Cas12a核酸酶及crRNA骨架序列的關鍵功能元件及基序序列、核酸酶活性及穩定性相關關鍵氨基酸改造,建構了高效基于單轉錄單元(STU)的Mb3Cas12a植物基因組編輯系統.進一步應用工作中,在水稻、玉米及番茄中,實作了有效的蛋白編碼基因敲除編輯、啟動子調控序列編輯、microRNA功能性敲除編輯,豐富了植物基因組編輯工具箱.全文主要研究結果簡述如下:
1、 CRISPR-Cas12核酸酶新成員植物基因組編輯活性及特性分析
研究人員首先基于所在團隊之前開發的雙Pol II啟動子驅動的Cas12a植物基因組編輯骨架底盤(Tang et al., 2017),針對三個Cas12a同系物(HkCas12a、Mb3Cas12a、PrCas12a)建構了植物基因組編輯骨架載體(圖1a、1b).進而,基于“原生質體瞬時轉化+擴增子通量測序”政策,在水稻細胞中評估了其在5’-VTTTV-3’ PAM位點和5’-VTTV-3’ PAM位點的編輯效率.實驗結果表明:HkCas12a在5’-TTTC-3’和5’-TTTG-3’位點上顯示較高編輯效率(36.4%-60.8%),但在5’-VTTTA-3’位點上效率較低(8.3%);Mb3Cas12a在所有位點上顯示40.0%以上的平均編輯效率,與LbCas12a相當;PrCas12a在5’-TTTG-3’位點上顯示出較高編輯效率(>40.0%),但在5’-TTTA-3’和5’-TTTC-3’位點上效率較低(3.9%-7.3%)(圖1c).同時,在5’-VTTV-3’ PAM位點的編輯效率,Mb3Cas12a也在所有位點上顯示了高效的編輯活性(圖1d).進一步水稻穩定轉化實驗中,針對水稻内源基因,測試了Mb3Cas12a在3個5’-TTTV-3’ PAM位點和5個5’-TTV-3’ PAM位點的穩定編輯效率.實驗結果表明,Mb3Cas12a在所有目标位點均實作了有效編輯,5’-TTTV-3’ PAM位點的編輯效率為70.0%-100%,5’-TTV-3’ PAM位點的編輯效率為20.0%-70.0%(圖1e-f).
圖 1 3種新CRISPR-Cas12a在植物基因組編輯中PAM基序識别分析
2、 Mb3Cas12a植物基因組編輯特性分析進一步的通量編輯資料分析,發現HkCas12a、Mb3Cas12a及PrCas12a在水稻細胞中顯示多樣化的編輯特性:1)3個新Cas12a編輯工具誘導的突變主要是多堿基删除(圖2a),且删除編輯事件為6bp-12bp的删除(圖2b-2d),删除位置在PAM遠端13到27nt(圖2e-2g);2)使用存在堿基錯配的spacer時,3種Cas12a除對PAM遠端3bp的錯配表現一定容錯外,均展現了明确的高特異性(圖2h-2k);3)HkCas12a和Mb3Cas12a在crRNA長度為19到23nt時可以産生有效編輯,而PrCas12a需要更長的spacer來實作有效編輯(圖2l-2o).
圖 2 3種新CRISPR-Cas12a在植物基因組編輯中的特性研究
3、 基于Mb3Cas12a的高效水稻多基因共編輯
進一步,針對3個水稻内源基因靶位點(OsDEP1-crR1、OsROC5-crR2、OsmiR528-crR3),研究人員基建構、比較了單Pol II啟動子的STUHDH(Tang et al., 2016; Tang et al., 2019; Zhang et al., 2021)和雙Pol II啟動子的Dual Pol II多基因共編輯系統(圖3a、3b).穩定遺傳轉化單株的Sanger測序分析結果顯示,基于雙核酶的STUHDH和Dual Pol II系統具有相當的多重編輯效率,在所有靶位點上産生了94.1%-100%的突變(圖3b).其中STUHDH系統的雙等位基因編輯效率範圍為41.2%-94.1%,與Dual Pol II系統相當(61.1%-94.4%)(圖3c-d),并且大多數植株在3個靶基因上産生了共編輯(圖3b).
圖 3 CRISPR-Mb3Cas12a在水稻中實作高效多基因共編輯
4、 Mb3Cas12a STUHDH植物基因組編輯系統多因素優化
考慮到基于雙核酶的Mb3Cas12a STUHDH系統相較于Dual Pol II系統,具有結構簡單、元件使用率高的優勢,研究人員針對STUHDH系統進行進一步優化:1)優化了Mb3Cas12a和crRNA之間的linker序列,比較了Triplex、Comp.14以及初始STUHDH版本中的PolyA三種結構(圖4a),發現PolyA在三種結構中表現突出(效率範圍從23.7%-42.2%),Comp.14的編輯效率略低于PolyA(效率範圍從12.1%-38.3%),而Triplex與PolyA相比編輯效率顯著降低(效率範圍從14.7%-27.1%)(圖4b);2)優化NLS結構,比較了3C NLS(3x SV40 NLS位于Cas12aC端)、2C NLS(SV40 NLS-np NLS位于Cas12aC端)以及原始載體中使用的NC NLS(SV40 NLS與np NLS分别位于Cas12aN端和C端(圖4c),發現NC NLS在三個系統中表現突出(效率範圍從36.2%-69.1%),3C NLS的編輯效率略低于NC NLS(效率範圍從32.5%-60.5%),而2C NLS總體上編輯效率較低(效率範圍從8.5%-65.2%)(圖4d);3)優化DR結構,分析了六個具有不同loop序列的DR(4n61、4n91、4n96、4n128、4n137、4n149)以及Mb3Cas12a的DR(Mb3 DR)在水稻内源位點上的編輯活性(圖4e),發現4n96 DR在所有7個DR中效率最高(效率範圍從17.3%-59.3%),4n61 DR和4n91 DR與Mb3 DR顯示出相當的活性,編輯效率範圍分别為9.6%-46.2%、10.9%-42.9%.綜上結果,該研究通過使用PolyA、NC NLS和4n96 DR,開發了高效的Mb3Cas12a STUHDH植物基因組編輯系統.
圖 4 CRISPR-Mb3Cas12a STUHDH植物基因組編輯系統多因素優化
Cas12a核酸酶對低溫敏感,研究人員進一步對Mb3Cas12a核酸酶D172、N573和K579關鍵氨基酸,設計了3個Mb3Cas12a變體,Mb3Cas12a-R(D172R)、Mb3Cas12a-RRR(D172R/N573R/K579R)、Mb3Cas12a-RVRR(N573R/K579V/N583R/K635R),并基于優化的STUHDH系統進行室溫編輯能力評價(圖4g).結果顯示:32°C時,Mb3Cas12a、Mb3Cas12a-R和Mb3Cas12a-RRR顯示出相當的編輯效率(平均效率分别為42.7%、43.0%和45.4%)(圖4h);在28°C時,Mb3Cas12a顯示編輯效率降低,而Mb3Cas12a-R和Mb3Cas12a-RRR在保持了高編輯效率(圖4h);在22°C時,所有Mb3Cas12a基因組編輯效率均有下降,但Mb3Cas12a-R和Mb3Cas12a-RRR變體在大多數靶位點上顯示了超過15.0%的編輯效率,比野生型Mb3Cas12a高出兩倍(圖4h-4i).
5、CRISPR-Mb3Cas12a在水稻啟動子編輯中的應用
研究人員使用優化的Mb3Cas12a STUHDH系統針對水稻重要農藝性狀相關基因進行啟動子編輯.首先,針對OsGBSS1啟動子設計了12個crRNA(圖5a-b),對19個T0植株的分析顯示,穩定轉化材料在多個靶位點上實作了有效編輯,其中編輯事件為多堿基删除.進一步分析了五個純合T1啟動子編輯植株,這些植株攜帶了不同大小的删除(圖5c),且啟動子編輯水稻植株中OsGBSS1表達水準及籽粒中直鍊澱粉含量有效降低(圖5d-5f),其他主要農藝性狀(圖5g-5m)與WT植株相似.
圖 5 基于Mb3Cas12a-STUHDH系統的高效水稻啟動子編輯
研究人員進一步針對水稻OsD18啟動子設計了12個crRNA,基于優化的Mb3Cas12a STUHDH系統建構了OsD18啟動子多重編輯系統(圖5n-5o),對18個T0株系的分析顯示,穩定轉化材料在靶位點上實作了多堿基删除有效編輯.對4個攜帶了不同大小删除的純合T1水稻株系進行分析(圖5p),發現這些啟動子編輯株系中OsD18表達水準降低(圖5q),植株呈現半矮化(平均高度從78.5cm-98.0cm,WT植物平均株高為106.0cm)(圖5r、5t),除主穗的長度和主穗粒量(圖5s-5u)有相對減少及分蘖數量增加外(圖5v),OsD18啟動子編輯株系的種子長度(圖5w)、千粒重(圖5x)和種子結實率(圖5y)沒有顯著變化.
6、基于Mb3Cas12a-RRR的玉米基因組編輯系統建構
接下來,研究人員基于低溫耐受的Mb3Cas12a-RRR核酸酶開發了玉米基因組編輯系統(圖6a),通過玉米原生質體轉化,分析了其在6個靶位點的編輯效率.其中2個位點顯示了17.8%-28.6%的編輯效率,另外4個位點效率偏低(2.4%-4.6%)(圖6b),這表明spacer序列和基因組位置選擇對玉米基因組編輯效率影響明顯.同樣,Mb3Cas12a-RRR在玉米中的編輯事件主要發生在PAM遠端,且為8-11bp的多堿基删除(圖6c-6d).進一步,通過農杆菌介導的穩定轉化方法,研究人員創制了祥249(X249)玉米自交系的ZmMIR159f穩定編輯材料(圖6e),在4株轉基因陽性材料中,2株為多堿基删除(11bp-16bp)的編輯事件(圖6f),且有效删除了ZmMIR159成熟序列區域(圖6f),實作了基于Mb3Cas12a的玉米基因組非編碼RNA基因的有效敲除.
圖 6 基于Mb3Cas12a-RRR STUHDH的玉米編輯系統建構及非編碼RNA有效敲除編輯
7、基于Mb3Cas12a-RRR的番茄基因組編輯系統建構及多基因共編輯實作
研究人員基于Mb3Cas12a-RRR核酸酶變體,開發了雙子葉植物番茄基因組編輯工具,針對8個番茄内源靶向位點,對比了多種Cas12a編輯活性(圖7a).結果顯示,Mb3Cas12a-RRR在番茄中顯示最佳編輯活性,所有靶位點的編輯效率均大于10.0%(圖7b),編輯事件同樣為多堿基删除(圖7c).進一步基于Mb3Cas12a-RRR STUHDH系統,針對SlMYBATV、SlGGP1和SlCYCB建構了多基因共編輯載體(圖7d),通過農杆菌介導的穩定轉化,随機選擇25株轉基因植株,進行Sanger測序和分析,發現SlMYBATV-cR、SlGGP1-cR和SlCYCB-cR位點的編輯效率分别為8.0%、12.0%和16.0%,雙等位基因編輯效率分别為0%、12.0%和4.0%(圖7e),三個基因的共編輯效率為4.0%,兩個基因的共編輯效率為12.0%(圖7f-g).481-5、481-10、481-11和481-16番茄共編輯植株果實中番茄紅素含量顯著增加(圖7h、7i).
圖 7 基于Mb3Cas12a-RRR STUHDH系統的番茄基因組編輯系統建構及多基因共編輯實作
西部(重慶)科學城種質創制大科學中心劉詩詩博士、何瑤博士為論文共同第一作者,西南大學生命科學學院/電子科技大學生命科學與技術學院張勇教授(http://smkxxy.swu.edu.cn/info/1014/2396.htm;https://scholar.google.com/citations?user=U3PtmKoAAAAJ&hl=en)、馬裡蘭大學Yiping Qi教授、北京科技大學安學麗教授為該研究工作共同通訊作者.研究工作得到了國家科技重大專項、國家自然科學基金等項目的資助.
論文連結:
http://doi.org/10.1111/pbi.14486
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