今天推送的文章發表在ACS Catalysis的“Functional Application of the Single-Module NRPS-like d-Alanyltransferase in Maytansinol Biosynthesis”，通訊作者為山東大學的朱德裕副教授和沈月毛教授。
在聚酮天然産物的生物合成中，某些PKS後修飾大大提高了生物活性潛力，但在目标化合物的合成中卻面臨着獨特的挑戰。Maytansinol是maytansine衍生抗體-藥物偶聯物的直接前體，也是研究微管動力學的探針。目前産生Maytansinol的過程主要依賴于還原水解來去除ansamitocins的3-O-酰基，反應條件苛刻，并不可避免地形成副産物。非核糖體肽合成酶（NRPS）作為多子產品組裝線，催化具有強大生物活性的各種肽天然産物的生物合成。AstC是一種在鍊黴菌屬中發現的獨特的A-T-TE三結構域NRPS樣酶（圖1A），是一種O-d-丙氨酰轉移酶，負責将d-丙氨酰基特異性負載到ansatrinein的11-OH上。然而在典型NRPS的功能中，d構型氨基酸的摻入很少通過a結構域的直接激活而發生，而是依賴于E結構域介導的差向異構化。
在本研究中，作者闡明了AstC的TE結構域在分子間酯化中的功能，并揭示了其對酰基供體和聚酮受體的底物混雜性。通過基因組挖掘，鑒定了一種新的AstC同源物SmAstC，并表明SmAstC對從放線菌HGF052中獲得的ansamitocins前體DDM的d-丙氨酰化表現出最高的催化活性。利用TE結構域的寬底物選擇性和d-丙氨酰化産物的自發水解傾向，通過将編碼SmAstC的基因引入HGF052中，對ansamitocins生物合成的PKS後修飾進行了重新程式設計，使該工程菌株中的ansamitocins生物合成途徑轉向生産maytansinol。
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AstC的TE結構域催化分子間酯化反應
AstC在将d-丙氨酸轉移到ansatriens的11-OH中的作用此前已被揭示。然而，其結構域的精确功能仍然不清楚，特别是TE結構域在催化分子間酯化中的作用。在本研究中，作者純化了AstC的TE結構域（AstC-TE），并利用d-丙氨酰N-乙酰半胱胺硫酯（d-丙氨酰基SNAC）作為酰基供體來檢測其活性。AstC-TE與d-丙氨酰SNAC和三烯甲基甲醇（1）的孵育成功形成11-O-d-丙氨酰基三烯甲基醇（2），與用全長AstC進行的酶測定結果一緻（圖1B）。
系統發育分析強調AstC-TE是催化氨基酰基供體和聚酮骨架之間分子間酯化的獨特催化劑（圖1C）。與AstC位于同一分支内的另外兩個TE（Sln9 TE和FrsA TE）來源于具有C-A-T-TE結構的可比單子產品NRPS，該結構負責修飾氨基酸和多肽的分子間酯化。AstC-TE與代表性的I型TE的序列比對顯示了保守的GXSXG基序，但在催化三聯體的組成上存在差異。在NRPS的TE結構域中，經典的Ser-Asp-His三聯體通常是保守的，但AstC-TE由Ser-Asn-His組成催化三聯體。為了評估這種取代對催化活性的影響，作者對AstC-TE的N117殘基進行了突變。AstC-TE的N117D突變體表現出5倍的活性下降，而N117A突變體完全消除了活性（圖1D）。在AstC-TE中觀察到的這種獨特的結構特征将其與其他TE區分開來，并有助于鑒定相關的同源酶。
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AstC-TE結構域的底物範圍
由于AstC-TE已被證明獨立催化酰基供體和受體之間的分子間酯化，作者開始探索AstC-TE對具有不同酰基SNAC和具有不同主鍊的ansamycins的底物範圍。之前一些d-氨基酸的摻入是用全長AstC實作的，但不能實作l-氨基酸的摻入。作者化學合成了幾種l-氨基酰基SNAC，并将其用作AstC-TE酶促測定的底物。結果表明，先前未被全長蛋白利用的l-丙氨酸、l-甲氧基、l-亮氨酸和l-苯丙氨酸部分可以由獨立的AstC TE完成（圖2A）。AstC-TE确實對不同的酰基供體表現出廣泛的相容性，全長AstC對具有小側鍊的d-氨基酸的嚴格偏好将歸因于其A結構域。
基于以SNAC形式提供的次優酰基供體，随後利用全長AstC來篩選對作為酰基受體的一系列ansamycins的相容性。通過ESI-HRMS分析對d-丙氨酰化産物的檢測表明，AstC能夠對兩種不同類型的五酮基ansamycin和兩種八酮基ansamicin進行d-丙氨酰基化，表現出對酰基受體的高度混雜性（圖2B）。
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同源酶的發現及其特異性d-丙氨酸化的結構基礎
在SSN網絡中觀察到的，AstC不是一個分離的實體，而是屬于一簇同源酶，包括AnsC和MycC，它們以前在其他ansatreinin生物合成途徑中被鑒定，但仍未被表征。作者使用最大似然法建構了這些AstC同源物的系統發育樹。選擇來自不同分支的六種同源物，即SyAstC、SmAstC、AnsC、MycC、SlAstC和KbAstC（圖2C）作為天然突變體，以鑒定對DDM具有增強活性的潛在候選者。結果表明，這些酶表現出對d-丙氨酸作為酰基供體的強烈偏好（圖S9A）。
在NRPS的組裝中，d-氨基酸的摻入通常依賴于差向異構結構域。然而，A-T-TE三結構域d-丙氨酸轉移酶中E結構域的缺失表明A結構域直接激活了d-丙氨酸。為了闡明構型偏好，作者分别對這六種d-丙氨酰轉移酶的A結構域進行了結晶篩選，成功獲得了SyAstC的A結構區與d-丙氨基腺苷酸中間體的模拟物d-Ala-SA的複合共晶結構（圖2D）。由殘基F211、D212、G304、V310和W311形成的空腔被假定為d-丙氨酰部分的結合位點。d-丙氨酰氨基分别與D212的羧基、G304的羰基和V310的主鍊形成氫鍵。這種排列與在d-丙氨酰載體蛋白連接配接酶DltA（PDB ID:3DHV）中觀察到的完全一緻。
DltA中的C269殘基被認為是決定對d-對映體偏好的關鍵決定因素，在SyAstC a結構域中相應地被A280取代，而W311的側鍊在DltA中占據了與C269相似的空間，其吲哚基團位于距離d-丙氨酰部分的α-碳3.4Å的位置。這表明W311支配對映體偏好，這得到了在W311A突變體中觀察到的對l-丙氨酸活性增加的支援。
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SmAstC催化DDM的3-O-d亞烷基化反應
使用最佳底物d-丙氨酸作為酰基供體，六種選擇的d-丙氨酸基轉移酶（SyAstC、SmAstC、AnsC、MycC、SlAstC和KbAstC）在催化DDM（3）轉化為3-O-d-丙氨酸基DDM（4）的能力方面顯示出顯著的差異。其中，SmAstC對3的催化活性最高，與AstC相比增加了8倍（圖3A）。
SmAstC是一種與AstC具有89.6%序列同一性的同源物，詳細的底物特異性動力學分析表明，SmAstC表現出對d-丙氨酸作為其酰基供體的明顯偏好，對d-絲氨酸、甘氨酸和l-丙氨酸的催化效率顯著較低。此外，這一觀察結果表明，d-丙氨酸化産物4的積累并沒有随着時間的推移而持續，而是逐漸減少。一系列pH值範圍内的穩定性評估揭示了4的自發水解傾向，在堿性條件下顯著加速（圖3C）。這種自發水解被初步認為是通過d-丙氨酸氨基的相鄰基團參與而發生的。
在優化的酶促pH和溫度條件下，在初始速度階段測量SmAstC的動力學參數，顯示d-丙氨酸的轉化率為8.8±0.9μM，kcat為11.9±0.5 min-1（圖3D）。3的表觀Km和kcat值分别為0.24±0.03 mM和0.28±0.02 min-1，而1的表觀Km和kcat分别為44±5μM和24.0±0.8 min-1（圖3D）。這些表征揭示了SmAstC對天然和非天然底物的底物親和力和催化效率的顯著變化。
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合成Maytansinol
為了評估SmAstC在體内對DDM（3）的活性，作者将SmAstC基因整合在HGF052菌株染色體上，所得到的菌株HGFS01在代謝産物譜中表現出顯著的變化，顯著積累了maytansinol（5）（圖4A）。HGF052中3-O-酰基轉移酶基因asm19的破壞阻礙了下遊修飾酶對DDM的有效催化，是以僅檢測到微量的maytansinol。在HGFS01菌株中，maytansinol的産生歸因于SmAstC催化的DDM的3-O-丙氨酰化，以及随後分别由Asm11和Asm10催化的4,5-環氧化和N-甲基化反應，未檢測到3-O-丙氨基DDM(4)證明了這一點。
對HGFS01菌株發酵産物的EIC峰的分析揭示了與d-丙氨酰化産物相對應的不同信号的存在，例如N-去甲基-3-O-丙氨酰-maytansinol(6)和3-O-丙氨酰基-maytansinol(7)，以及它們相應的水解産物N-去甲基-maytansinol(8)和maytansinol 5（圖4A）。這些結果證明了SmAstC在體内的作用和Maytansinol的生物合成過程（圖4B）。SmAstC催化的DDM的3-O-d-丙氨酰化恢複了由3-O-酰基轉移酶基因asm19敲除引起的ansamitocin PKS後修飾步驟的中斷，允許下遊的4,5-環氧化和酰胺N-甲基化。3-O-d-alanyl maytansinol 的自發水解導緻maytansinol 作為主要代謝産物的産生。
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對SmAstC-TE域的合理設計
之前的研究表明，通路特異性正轉錄調節基因asm18的過表達有效地增加了DDM的産生(3)。然而在asm18過表達的突變體HGFS04中，SmastC基因的過表達未能顯著增強Maytansinol的産生。這表明高水準的DDM沒有有效地轉化為Maytansinol，SmAstC催化的DDM的d-丙氨酰化是該生物合成過程中的限速步驟。是以，作者通過合理的設計方法，關注SmAstC-TE結構域（SmAstC-TE），提高了SmAstC對DDM的催化效率（圖5A）。由于難以獲得SmAstC-TE結構域的蛋白質晶體或與其底物的共晶體，作者利用AlphaFold2預測的結構模型進行了合理設計。SmAstC-TE和holo-EntF-T-TE結構域的結構比對闡明了SmAstC-TE中酰基供體通道的排列以及酰基受體的相應結合口袋。随後利用Cov_Dox伺服器，使用預測的催化中間體和SmAstC TE，進行共價對接模拟，模拟d-丙氨酰化的過渡狀态（圖5B）。
為了評估底物結合口袋内DDM相關殘基的影響，對配體4Å内的殘基進行丙氨酸掃描誘變（圖S21）。W89和F91在保守的GXSXG基序中突變為丙氨酸導緻酶活性的急劇降低。殘基L26、N119、I140、V212和E239被鑒定為熱點殘基，用于使用FuncLib伺服器的多點誘變設計。結果表明，M2突變體表現出最高的活性，與野生型酶相比，活性增加了41%（圖5C）。此外，選擇位于口袋外表面的殘基K125、L136和F190進行誘變，以評估它們對DDM催化效率的潛在影響。K125A突變體顯示出酶活性的顯著增強，而L136A突變體對活性有輕微影響，W190A突變完全消除了産物的形成（圖5D）。為了進一步研究殘基K125的影響，進行了集中合理的疊代位點特異性誘變，随後評估了所産生的突變體表現出的活性變化。在K125突變為龐大殘基時觀察到的活性降低表明，K125施加的空間影響似乎是影響觀察到的活動變化的主要因素。M2突變體(SmAstCM)的K125G突變最終導緻4的體外産量增加3.2倍。SmAstCM的kcat/Km值是SmAstC的2.8倍，表明對DDM的底物特異性有所提高（圖5E）。
為了探測SmAstCM突變體的體内催化活性，作者通過過表達asm18和SmAstCM基因建構了HGFS06。研究發現，HGFS06中Maytansinol的産率是HGFS05中的2.4倍（圖6A），證明了合理設計提高SmAstC對DDM催化效率的有效性。8的積累表明随後的修飾步驟對DDM向Maytansinol的整體轉化的潛在限制（圖6A）。asm11和asm10基因的進一步過表達有助于8轉化為Maytansinol，但未能顯著提高Maytansinol的産量，可能是由于影響了該菌株的整體代謝狀态。最近開發的模拟DEBS酶組裝線政策，實作了關鍵級聯酶的有序組裝，提高了協同催化效率，該政策被用于組裝SmAstCM、Asm11和Asm10，旨在減少中間代謝産物的積累并加速向美他新醇的轉化（圖6B）。所産生的HGFS08菌株通過固态發酵顯著增加了Maytansinol的産量（圖6C）。為了驗證工程菌株用于放大發酵的有效性，使用實驗室規模的生物反應器進行了3L發酵，以評估HGFS08的性能。發酵10天後獲得Maytansinol，産率為25±2 mg/L。