今天推送的文章发表在ACS Catalysis的“Functional Application of the Single-Module NRPS-like d-Alanyltransferase in Maytansinol Biosynthesis”，通讯作者为山东大学的朱德裕副教授和沈月毛教授。
在聚酮天然产物的生物合成中，某些PKS后修饰大大提高了生物活性潜力，但在目标化合物的合成中却面临着独特的挑战。Maytansinol是maytansine衍生抗体-药物偶联物的直接前体，也是研究微管动力学的探针。目前产生Maytansinol的过程主要依赖于还原水解来去除ansamitocins的3-O-酰基，反应条件苛刻，并不可避免地形成副产物。非核糖体肽合成酶（NRPS）作为多模块组装线，催化具有强大生物活性的各种肽天然产物的生物合成。AstC是一种在链霉菌属中发现的独特的A-T-TE三结构域NRPS样酶（图1A），是一种O-d-丙氨酰转移酶，负责将d-丙氨酰基特异性负载到ansatrinein的11-OH上。然而在典型NRPS的功能中，d构型氨基酸的掺入很少通过a结构域的直接激活而发生，而是依赖于E结构域介导的差向异构化。
在本研究中，作者阐明了AstC的TE结构域在分子间酯化中的功能，并揭示了其对酰基供体和聚酮受体的底物混杂性。通过基因组挖掘，鉴定了一种新的AstC同源物SmAstC，并表明SmAstC对从放线菌HGF052中获得的ansamitocins前体DDM的d-丙氨酰化表现出最高的催化活性。利用TE结构域的宽底物选择性和d-丙氨酰化产物的自发水解倾向，通过将编码SmAstC的基因引入HGF052中，对ansamitocins生物合成的PKS后修饰进行了重新编程，使该工程菌株中的ansamitocins生物合成途径转向生产maytansinol。
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AstC的TE结构域催化分子间酯化反应
AstC在将d-丙氨酸转移到ansatriens的11-OH中的作用此前已被揭示。然而，其结构域的精确功能仍然不清楚，特别是TE结构域在催化分子间酯化中的作用。在本研究中，作者纯化了AstC的TE结构域（AstC-TE），并利用d-丙氨酰N-乙酰半胱胺硫酯（d-丙氨酰基SNAC）作为酰基供体来检测其活性。AstC-TE与d-丙氨酰SNAC和三烯甲基甲醇（1）的孵育成功形成11-O-d-丙氨酰基三烯甲基醇（2），与用全长AstC进行的酶测定结果一致（图1B）。
系统发育分析强调AstC-TE是催化氨基酰基供体和聚酮骨架之间分子间酯化的独特催化剂（图1C）。与AstC位于同一分支内的另外两个TE（Sln9 TE和FrsA TE）来源于具有C-A-T-TE结构的可比单模块NRPS，该结构负责修饰氨基酸和多肽的分子间酯化。AstC-TE与代表性的I型TE的序列比对显示了保守的GXSXG基序，但在催化三联体的组成上存在差异。在NRPS的TE结构域中，经典的Ser-Asp-His三联体通常是保守的，但AstC-TE由Ser-Asn-His组成催化三联体。为了评估这种取代对催化活性的影响，作者对AstC-TE的N117残基进行了突变。AstC-TE的N117D突变体表现出5倍的活性下降，而N117A突变体完全消除了活性（图1D）。在AstC-TE中观察到的这种独特的结构特征将其与其他TE区分开来，并有助于鉴定相关的同源酶。
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AstC-TE结构域的底物范围
由于AstC-TE已被证明独立催化酰基供体和受体之间的分子间酯化，作者开始探索AstC-TE对具有不同酰基SNAC和具有不同主链的ansamycins的底物范围。之前一些d-氨基酸的掺入是用全长AstC实现的，但不能实现l-氨基酸的掺入。作者化学合成了几种l-氨基酰基SNAC，并将其用作AstC-TE酶促测定的底物。结果表明，先前未被全长蛋白利用的l-丙氨酸、l-甲氧基、l-亮氨酸和l-苯丙氨酸部分可以由独立的AstC TE完成（图2A）。AstC-TE确实对不同的酰基供体表现出广泛的兼容性，全长AstC对具有小侧链的d-氨基酸的严格偏好将归因于其A结构域。
基于以SNAC形式提供的次优酰基供体，随后利用全长AstC来筛选对作为酰基受体的一系列ansamycins的兼容性。通过ESI-HRMS分析对d-丙氨酰化产物的检测表明，AstC能够对两种不同类型的五酮基ansamycin和两种八酮基ansamicin进行d-丙氨酰基化，表现出对酰基受体的高度混杂性（图2B）。
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同源酶的发现及其特异性d-丙氨酸化的结构基础
在SSN网络中观察到的，AstC不是一个分离的实体，而是属于一簇同源酶，包括AnsC和MycC，它们以前在其他ansatreinin生物合成途径中被鉴定，但仍未被表征。作者使用最大似然法构建了这些AstC同源物的系统发育树。选择来自不同分支的六种同源物，即SyAstC、SmAstC、AnsC、MycC、SlAstC和KbAstC（图2C）作为天然突变体，以鉴定对DDM具有增强活性的潜在候选者。结果表明，这些酶表现出对d-丙氨酸作为酰基供体的强烈偏好（图S9A）。
在NRPS的组装中，d-氨基酸的掺入通常依赖于差向异构结构域。然而，A-T-TE三结构域d-丙氨酸转移酶中E结构域的缺失表明A结构域直接激活了d-丙氨酸。为了阐明构型偏好，作者分别对这六种d-丙氨酰转移酶的A结构域进行了结晶筛选，成功获得了SyAstC的A结构区与d-丙氨基腺苷酸中间体的模拟物d-Ala-SA的复合共晶结构（图2D）。由残基F211、D212、G304、V310和W311形成的空腔被假定为d-丙氨酰部分的结合位点。d-丙氨酰氨基分别与D212的羧基、G304的羰基和V310的主链形成氢键。这种排列与在d-丙氨酰载体蛋白连接酶DltA（PDB ID:3DHV）中观察到的完全一致。
DltA中的C269残基被认为是决定对d-对映体偏好的关键决定因素，在SyAstC a结构域中相应地被A280取代，而W311的侧链在DltA中占据了与C269相似的空间，其吲哚基团位于距离d-丙氨酰部分的α-碳3.4Å的位置。这表明W311支配对映体偏好，这得到了在W311A突变体中观察到的对l-丙氨酸活性增加的支持。
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SmAstC催化DDM的3-O-d亚烷基化反应
使用最佳底物d-丙氨酸作为酰基供体，六种选择的d-丙氨酸基转移酶（SyAstC、SmAstC、AnsC、MycC、SlAstC和KbAstC）在催化DDM（3）转化为3-O-d-丙氨酸基DDM（4）的能力方面显示出显著的差异。其中，SmAstC对3的催化活性最高，与AstC相比增加了8倍（图3A）。
SmAstC是一种与AstC具有89.6%序列同一性的同源物，详细的底物特异性动力学分析表明，SmAstC表现出对d-丙氨酸作为其酰基供体的明显偏好，对d-丝氨酸、甘氨酸和l-丙氨酸的催化效率显著较低。此外，这一观察结果表明，d-丙氨酸化产物4的积累并没有随着时间的推移而持续，而是逐渐减少。一系列pH值范围内的稳定性评估揭示了4的自发水解倾向，在碱性条件下显著加速（图3C）。这种自发水解被初步认为是通过d-丙氨酸氨基的相邻基团参与而发生的。
在优化的酶促pH和温度条件下，在初始速度阶段测量SmAstC的动力学参数，显示d-丙氨酸的转化率为8.8±0.9μM，kcat为11.9±0.5 min-1（图3D）。3的表观Km和kcat值分别为0.24±0.03 mM和0.28±0.02 min-1，而1的表观Km和kcat分别为44±5μM和24.0±0.8 min-1（图3D）。这些表征揭示了SmAstC对天然和非天然底物的底物亲和力和催化效率的显著变化。
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合成Maytansinol
为了评估SmAstC在体内对DDM（3）的活性，作者将SmAstC基因整合在HGF052菌株染色体上，所得到的菌株HGFS01在代谢产物谱中表现出显著的变化，显著积累了maytansinol（5）（图4A）。HGF052中3-O-酰基转移酶基因asm19的破坏阻碍了下游修饰酶对DDM的有效催化，因此仅检测到微量的maytansinol。在HGFS01菌株中，maytansinol的产生归因于SmAstC催化的DDM的3-O-丙氨酰化，以及随后分别由Asm11和Asm10催化的4,5-环氧化和N-甲基化反应，未检测到3-O-丙氨基DDM(4)证明了这一点。
对HGFS01菌株发酵产物的EIC峰的分析揭示了与d-丙氨酰化产物相对应的不同信号的存在，例如N-去甲基-3-O-丙氨酰-maytansinol(6)和3-O-丙氨酰基-maytansinol(7)，以及它们相应的水解产物N-去甲基-maytansinol(8)和maytansinol 5（图4A）。这些结果证实了SmAstC在体内的作用和Maytansinol的生物合成过程（图4B）。SmAstC催化的DDM的3-O-d-丙氨酰化恢复了由3-O-酰基转移酶基因asm19敲除引起的ansamitocin PKS后修饰步骤的中断，允许下游的4,5-环氧化和酰胺N-甲基化。3-O-d-alanyl maytansinol 的自发水解导致maytansinol 作为主要代谢产物的产生。
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对SmAstC-TE域的合理设计
之前的研究表明，通路特异性正转录调节基因asm18的过表达有效地增加了DDM的产生(3)。然而在asm18过表达的突变体HGFS04中，SmastC基因的过表达未能显著增强Maytansinol的产生。这表明高水平的DDM没有有效地转化为Maytansinol，SmAstC催化的DDM的d-丙氨酰化是该生物合成过程中的限速步骤。因此，作者通过合理的设计方法，关注SmAstC-TE结构域（SmAstC-TE），提高了SmAstC对DDM的催化效率（图5A）。由于难以获得SmAstC-TE结构域的蛋白质晶体或与其底物的共晶体，作者利用AlphaFold2预测的结构模型进行了合理设计。SmAstC-TE和holo-EntF-T-TE结构域的结构比对阐明了SmAstC-TE中酰基供体通道的排列以及酰基受体的相应结合口袋。随后利用Cov_Dox服务器，使用预测的催化中间体和SmAstC TE，进行共价对接模拟，模拟d-丙氨酰化的过渡状态（图5B）。
为了评估底物结合口袋内DDM相关残基的影响，对配体4Å内的残基进行丙氨酸扫描诱变（图S21）。W89和F91在保守的GXSXG基序中突变为丙氨酸导致酶活性的急剧降低。残基L26、N119、I140、V212和E239被鉴定为热点残基，用于使用FuncLib服务器的多点诱变设计。结果表明，M2突变体表现出最高的活性，与野生型酶相比，活性增加了41%（图5C）。此外，选择位于口袋外表面的残基K125、L136和F190进行诱变，以评估它们对DDM催化效率的潜在影响。K125A突变体显示出酶活性的显著增强，而L136A突变体对活性有轻微影响，W190A突变完全消除了产物的形成（图5D）。为了进一步研究残基K125的影响，进行了集中合理的迭代位点特异性诱变，随后评估了所产生的突变体表现出的活性变化。在K125突变为庞大残基时观察到的活性降低表明，K125施加的空间影响似乎是影响观察到的活动变化的主要因素。M2突变体(SmAstCM)的K125G突变最终导致4的体外产量增加3.2倍。SmAstCM的kcat/Km值是SmAstC的2.8倍，表明对DDM的底物特异性有所提高（图5E）。
为了探测SmAstCM突变体的体内催化活性，作者通过过表达asm18和SmAstCM基因构建了HGFS06。研究发现，HGFS06中Maytansinol的产率是HGFS05中的2.4倍（图6A），证明了合理设计提高SmAstC对DDM催化效率的有效性。8的积累表明随后的修饰步骤对DDM向Maytansinol的整体转化的潜在限制（图6A）。asm11和asm10基因的进一步过表达有助于8转化为Maytansinol，但未能显著提高Maytansinol的产量，可能是由于影响了该菌株的整体代谢状态。最近开发的模拟DEBS酶组装线策略，实现了关键级联酶的有序组装，提高了协同催化效率，该策略被用于组装SmAstCM、Asm11和Asm10，旨在减少中间代谢产物的积累并加速向美他新醇的转化（图6B）。所产生的HGFS08菌株通过固态发酵显著增加了Maytansinol的产量（图6C）。为了验证工程菌株用于放大发酵的有效性，使用实验室规模的生物反应器进行了3L发酵，以评估HGFS08的性能。发酵10天后获得Maytansinol，产率为25±2 mg/L。