今天推送的文章發表在Bioresource Technology上的“Development of a two-enzyme system in Aspergillus niger for efficient production of N-acetyl-β-D-glucosamine from powdery chitin”，作者為中國農業大學的楊紹青教授。
甲殼素是一種線性多糖，由N-乙酰基-D-葡萄糖胺(GlcNAc)單元通過β-1,4鍵連接配接而成，是自然界中最豐富的生物聚合物之一，特别是在蝦殼和蟹殼等海洋廢物中，每年産生超過1011噸固體廢物。GlcNAc作為甲殼素的單體單元，據報道具有多種生物活性，例如抗炎、抗惡性良性腫瘤和抗氧化活性。目前，GlcNAc以甲殼素為原料，通過高溫強酸水解進行商業化生産，但仍存在産率低、産品穩定性差、環境污染風險等缺點。在溫和條件下酶解天然甲殼素是GlcNAc生産的一種綠色且有前景的政策，其中幾丁質分解酶發揮着關鍵作用。幾丁質向GlcNAc的酶促生物轉化需要兩種類型的酶的共同作用，即幾丁質酶(EC 3.2.1.14)通過催化幾丁質中的β-1,4鍵水解産生N-乙酰基COS，而β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(GlcNAcase，EC 3.2.1.52)則執行限速作用，進一步将N-乙酰基COS水解為GlcNAc。通過分子修飾提高幾丁質酶的比活性是提高幾丁質水解效率的候選方法。GlcNAcases可以切斷N-乙酰基COS和高結晶度的幾丁質，進而增加底物對幾丁質酶的接受性。黑曲黴是一種非常理想的細胞工廠，因為它具有蛋白質分泌效率高、抗自溶能力強、安全等獨特優勢，可能更适合建構協同酶系統。本研究探索了一種能夠分泌高水準内源性GlcNAcase的宿主菌株A.niger FBL-B(ΔglaA)。同時建構了雙酶協同系統。該系統允許從巴氏類芽孢杆菌(PbChi70)中高效生産設計的幾丁質酶以及内源性GlcNAcases，以有效轉化粉末幾丁質。
幾丁質酶基因突變體篩選及表達
通過易錯PCR，建構了突變頻率為0.5%的突變體文庫。兩輪篩選的總結和每個階段選擇的突變體數量如圖1所示。在篩選的第一階段，使用膠體幾丁質闆對突變體文庫（包含10000個克隆）進行預篩選。超過45%的克隆表現出清晰的斑點，其中選擇了215個表現出與對照（無突變）大小相當或更大的克隆。随後，培養標明的克隆并将其引入搖瓶（50 mL）中，并對分泌的幾丁質酶進行表征。最終，獲得了比活性顯着提高的突變體（mPbChi70）（圖1）。DNA測序顯示mPbChi70中有3個突變位點（Asp50Val、Glu190Gly和Phe272Trp）。多重氨基酸序列比對表明，Asp50Val和Phe272Trp在GH家族18幾丁質酶中保守，而Glu190Gly則不然。為了分析三種氨基酸對酶比活性的影響，通過定點突變分别産生了三種突變體。Asp50Val、Glu190Gly和Phe272Trp的突變使酶的比活性分别顯着提高了44%、65%和34%。
mPbChi70的生化表征
突變體（mPbChi70）在大腸杆菌BL21中成功以活性形式表達。然後将重組酶純化至均一并進行生化表征。與PbChi70相比，mPbChi70的最适pH值從5.5提高到6.5（圖2a），最适溫度從55 °C提高到60 °C（圖2c），而pH值和熱穩定性沒有觀察到或有微量差異（圖2b和d）。
與PbChi70相比，mPbChi70對膠體幾丁質和再生幾丁質的比活性分别顯着增加2.44和1.45倍。然而，在其他測試底物上沒有觀察到差異或差異很小（表1）。該突變不影響酶的Km值，但顯着提高了最大速度（Vmax）（1.7倍）和催化效率（2.0倍）（表2）。通過分子對接獲得mPbChi70及PbChi70與底物的最佳構象。該突變使結合能顯着增加了1.63倍（表2）。
本研究通過定向進化成功改造了PbChi70，篩選出的突變體比野生型酶的比活（73.21 U/mg）提高了2.4倍（表1）。該值明顯高于其他報道的幾丁質酶，其比活在2.1-66.2 U/mg範圍内，代表了迄今為止報道的幾丁質酶的最高比活性。結合自由能計算表明，與野生型（-6.15 kcal/mol）相比，突變體（-10.04 kcal/mol）與GF5表現出更高的結合親和力。有趣的是，突變并沒有影響mPbChi70的Km值，但顯着增加了Vmax值。與野生型酶相比，催化效率（kcat/Km）顯着提高了2倍（表2）。
mPbChi70的結構分析
作為GH家族18幾丁質酶的成員，PbChi70與其他結構特征幾丁質酶具有79%的最高氨基酸序列相似性，并具有經典的(β/α)8-TIM桶形折疊。根據PbChi70的模型結構，兩個取代（Asp50Val和Glu190Gly）位于酶分子的表面（圖3a）。取代Phe272位于催化槽底部，距底物的最小距離為2.1 Å。圖3b顯示，當Phe被Try取代時，與對接小分子的最短距離增加到3.4 Å，并且氨基酸支鍊的方向從催化槽内部轉向外部。定向進化後，催化槽右側區域的電荷分布發生轉移（圖3c）。
結構分析顯示，突變體mPbChi70中有三個取代（Asp50Val、Glu190Gly和Phe272Trp）（圖3a），兩個取代（Asp50Val和Glu190Gly）位于mPbChi70的表面（圖3c）。通過定點突變分别産生了兩種突變體。Asp50Val和Glu190Gly的突變導緻比活性分别增加44%(43.3 U/mg)和65%(49.7 U/mg)。根據蛋白質表面電荷分析（圖3c），催化槽邊界帶負電的殘基Glu190和Asp50分别被非極性殘基Gly和Val取代。這些取代基可能會影響酶表面的局部電荷平衡，進而提高酶的催化效率。Phe272Trp突變還導緻比活性顯着增加34%(40.3 U/mg)。為了進一步分析該突變位點的作用，利用分子對接進行了模拟分析（圖3b）。Phe272位于催化槽底部，與對接小分子底物的最小距離為2.1 Å，而取代後的Try272的最小距離增加到3.4 Å。另外，Phe272的支鍊在催化槽内，而Try272的支鍊在催化槽外。是以，推測該取代通過擴大催化槽通道、減少空間位阻、促進底物進入中心結合口袋、促進産物的釋放速率來提高mPbChi70的比活性。
mPbChi70在黑曲黴FBL-B(ΔglaA)中的分泌表達
mPbChi70基因在親本菌株A.niger FBL-B（ΔglaA）中成功表達，能夠分泌内源GlcNAcase。每μg DNA獲得大約200個抗性轉化子。選擇可産生高達8.03 U/mL的高幾丁質酶活性和310 U/mL的GlcNAcase活性的同源轉化子。然後将轉化子進行高細胞密度發酵，培養144 h後獲得最高的胞外幾丁質酶活性為61.33 U/mL，蛋白濃度為10.47 mg/mL（圖4a）。同時，GlcNAcase活性逐漸增加，在發酵結束時達到最高産量353.1 U/mL（圖4a）。初始階段（0~72 h）生物量增長較快，分批補料後增長速度減慢。整個發酵過程中總糖消耗量平穩增加，在發酵結束時達到157.3 g/L（圖4a）。通過SDS-PAGE和酶譜分析檢查上清液中分泌的幾丁質酶和GlcNAcase是否正确（圖4b）。
黑曲黴是一種有吸引力的蛋白質表達宿主，可以分泌高水準的異源蛋白質。本研究将工程化幾丁質酶轉化到能夠分泌高水準内源GlcNAcase的宿主菌株A.niger FBL-B（ΔglaA）中，成功建構了雙酶水解系統，這是第一個特異性的雙酶協同系統在A.niger中用于GlcNAc生産。在5 L發酵罐中通過高細胞密度發酵獲得了最高的幾丁質酶産量61.33 U/mL，GlcNAcase活性為353.1 U/mL（圖4a）。幾丁質酶活性明顯高于其他幾丁質酶，僅次于巴斯德畢赤酵母中地衣芽孢杆菌的幾丁質酶（168 U/mL）。雙酶混合物在初始階段有效水解膠體幾丁質主要産生(GlcNAc)2，并且在反應結束時形成的(GlcNAc)2進一步轉化為GlcNAc。
從粉末甲殼素轉化GlcNAc
評估了酶混合物從甲殼素生産GlcNAc的能力。通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察粉末甲殼素在酶降解過程中的形态變化。粉末甲殼素呈大顆粒狀，結構粗糙緻密。單獨使用mPbChi70處理不會導緻粉末甲殼素結構發生明顯變化。然而，雙酶混合物的處理顯着破壞了粉末甲殼素顆粒，并觀察到大量碎片。此外，雙酶混合物處理顯着降低了結晶度指數(CrI)，從70.9%降至56.1%。
分别通過mPbChi70和雙酶混合物對粉末甲殼素進行GlcNAc生物轉化。當粉末甲殼素單獨用mPbChi70水解時，轉化率為18.34%（産物主要為GlcNAc和(GlcNAc)2）（圖5a）。雙酶混合物的應用顯着提高了轉化率，24小時時轉化率高達71.9%（w/w），GlcNAc含量為7.19 mg/mL（圖5b）。GlcNAc是水解産物中唯一的主要産物，其純度高達95%（圖5c）。本研究利用黑曲黴共表達的mPbChi70和GlcNAcase組成的雙酶系統直接水解粉末甲殼素生産GlcNAc，轉化率最高達到71.9%（w/w）（圖5b)。該方法具有轉化率高、樣品易操作、成本低、無需專用大型裝置、實用性強等優點。本研究中獲得的GlcNAc純度高達95%(w/w)，無需純化（圖5c），甚至接近Sigma Co.Ltd.的商業GlcNAc（分析級，純度≥96%）。是以，本研究中的政策在GlcNAc的商業生産中可能具有巨大的應用潛力。
DOI：10.1016/j.biortech.2023.130024
文章連結：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2023.130024