今天推送的文章发表在Bioresource Technology上的“Development of a two-enzyme system in Aspergillus niger for efficient production of N-acetyl-β-D-glucosamine from powdery chitin”，作者为中国农业大学的杨绍青教授。
甲壳素是一种线性多糖，由N-乙酰基-D-葡萄糖胺(GlcNAc)单元通过β-1,4键连接而成，是自然界中最丰富的生物聚合物之一，特别是在虾壳和蟹壳等海洋废物中，每年产生超过1011吨固体废物。GlcNAc作为甲壳素的单体单元，据报道具有多种生物活性，例如抗炎、抗肿瘤和抗氧化活性。目前，GlcNAc以甲壳素为原料，通过高温强酸水解进行商业化生产，但仍存在产率低、产品稳定性差、环境污染风险等缺点。在温和条件下酶解天然甲壳素是GlcNAc生产的一种绿色且有前景的策略，其中几丁质分解酶发挥着关键作用。几丁质向GlcNAc的酶促生物转化需要两种类型的酶的共同作用，即几丁质酶(EC 3.2.1.14)通过催化几丁质中的β-1,4键水解产生N-乙酰基COS，而β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(GlcNAcase，EC 3.2.1.52)则执行限速作用，进一步将N-乙酰基COS水解为GlcNAc。通过分子修饰提高几丁质酶的比活性是提高几丁质水解效率的候选方法。GlcNAcases可以切断N-乙酰基COS和高结晶度的几丁质，从而增加底物对几丁质酶的接受性。黑曲霉是一种非常理想的细胞工厂，因为它具有蛋白质分泌效率高、抗自溶能力强、安全等独特优势，可能更适合构建协同酶系统。本研究探索了一种能够分泌高水平内源性GlcNAcase的宿主菌株A.niger FBL-B(ΔglaA)。同时构建了双酶协同系统。该系统允许从巴氏类芽孢杆菌(PbChi70)中高效生产设计的几丁质酶以及内源性GlcNAcases，以有效转化粉末几丁质。
几丁质酶基因突变体筛选及表达
通过易错PCR，构建了突变频率为0.5%的突变体文库。两轮筛选的总结和每个阶段选择的突变体数量如图1所示。在筛选的第一阶段，使用胶体几丁质板对突变体文库（包含10000个克隆）进行预筛选。超过45%的克隆表现出清晰的斑点，其中选择了215个表现出与对照（无突变）大小相当或更大的克隆。随后，培养选定的克隆并将其引入摇瓶（50 mL）中，并对分泌的几丁质酶进行表征。最终，获得了比活性显着提高的突变体（mPbChi70）（图1）。DNA测序显示mPbChi70中有3个突变位点（Asp50Val、Glu190Gly和Phe272Trp）。多重氨基酸序列比对表明，Asp50Val和Phe272Trp在GH家族18几丁质酶中保守，而Glu190Gly则不然。为了分析三种氨基酸对酶比活性的影响，通过定点突变分别产生了三种突变体。Asp50Val、Glu190Gly和Phe272Trp的突变使酶的比活性分别显着提高了44%、65%和34%。
mPbChi70的生化表征
突变体（mPbChi70）在大肠杆菌BL21中成功以活性形式表达。然后将重组酶纯化至均一并进行生化表征。与PbChi70相比，mPbChi70的最适pH值从5.5提高到6.5（图2a），最适温度从55 °C提高到60 °C（图2c），而pH值和热稳定性没有观察到或有微量差异（图2b和d）。
与PbChi70相比，mPbChi70对胶体几丁质和再生几丁质的比活性分别显着增加2.44和1.45倍。然而，在其他测试底物上没有观察到差异或差异很小（表1）。该突变不影响酶的Km值，但显着提高了最大速度（Vmax）（1.7倍）和催化效率（2.0倍）（表2）。通过分子对接获得mPbChi70及PbChi70与底物的最佳构象。该突变使结合能显着增加了1.63倍（表2）。
本研究通过定向进化成功改造了PbChi70，筛选出的突变体比野生型酶的比活（73.21 U/mg）提高了2.4倍（表1）。该值明显高于其他报道的几丁质酶，其比活在2.1-66.2 U/mg范围内，代表了迄今为止报道的几丁质酶的最高比活性。结合自由能计算表明，与野生型（-6.15 kcal/mol）相比，突变体（-10.04 kcal/mol）与GF5表现出更高的结合亲和力。有趣的是，突变并没有影响mPbChi70的Km值，但显着增加了Vmax值。与野生型酶相比，催化效率（kcat/Km）显着提高了2倍（表2）。
mPbChi70的结构分析
作为GH家族18几丁质酶的成员，PbChi70与其他结构特征几丁质酶具有79%的最高氨基酸序列相似性，并具有经典的(β/α)8-TIM桶形折叠。根据PbChi70的模型结构，两个取代（Asp50Val和Glu190Gly）位于酶分子的表面（图3a）。取代Phe272位于催化槽底部，距底物的最小距离为2.1 Å。图3b显示，当Phe被Try取代时，与对接小分子的最短距离增加到3.4 Å，并且氨基酸支链的方向从催化槽内部转向外部。定向进化后，催化槽右侧区域的电荷分布发生转移（图3c）。
结构分析显示，突变体mPbChi70中有三个取代（Asp50Val、Glu190Gly和Phe272Trp）（图3a），两个取代（Asp50Val和Glu190Gly）位于mPbChi70的表面（图3c）。通过定点突变分别产生了两种突变体。Asp50Val和Glu190Gly的突变导致比活性分别增加44%(43.3 U/mg)和65%(49.7 U/mg)。根据蛋白质表面电荷分析（图3c），催化槽边界带负电的残基Glu190和Asp50分别被非极性残基Gly和Val取代。这些取代基可能会影响酶表面的局部电荷平衡，从而提高酶的催化效率。Phe272Trp突变还导致比活性显着增加34%(40.3 U/mg)。为了进一步分析该突变位点的作用，利用分子对接进行了模拟分析（图3b）。Phe272位于催化槽底部，与对接小分子底物的最小距离为2.1 Å，而取代后的Try272的最小距离增加到3.4 Å。另外，Phe272的支链在催化槽内，而Try272的支链在催化槽外。因此，推测该取代通过扩大催化槽通道、减少空间位阻、促进底物进入中心结合口袋、促进产物的释放速率来提高mPbChi70的比活性。
mPbChi70在黑曲霉FBL-B(ΔglaA)中的分泌表达
mPbChi70基因在亲本菌株A.niger FBL-B（ΔglaA）中成功表达，能够分泌内源GlcNAcase。每μg DNA获得大约200个抗性转化子。选择可产生高达8.03 U/mL的高几丁质酶活性和310 U/mL的GlcNAcase活性的同源转化子。然后将转化子进行高细胞密度发酵，培养144 h后获得最高的胞外几丁质酶活性为61.33 U/mL，蛋白浓度为10.47 mg/mL（图4a）。同时，GlcNAcase活性逐渐增加，在发酵结束时达到最高产量353.1 U/mL（图4a）。初始阶段（0~72 h）生物量增长较快，分批补料后增长速度减慢。整个发酵过程中总糖消耗量平稳增加，在发酵结束时达到157.3 g/L（图4a）。通过SDS-PAGE和酶谱分析检查上清液中分泌的几丁质酶和GlcNAcase是否正确（图4b）。
黑曲霉是一种有吸引力的蛋白质表达宿主，可以分泌高水平的异源蛋白质。本研究将工程化几丁质酶转化到能够分泌高水平内源GlcNAcase的宿主菌株A.niger FBL-B（ΔglaA）中，成功构建了双酶水解系统，这是第一个特异性的双酶协同系统在A.niger中用于GlcNAc生产。在5 L发酵罐中通过高细胞密度发酵获得了最高的几丁质酶产量61.33 U/mL，GlcNAcase活性为353.1 U/mL（图4a）。几丁质酶活性明显高于其他几丁质酶，仅次于巴斯德毕赤酵母中地衣芽孢杆菌的几丁质酶（168 U/mL）。双酶混合物在初始阶段有效水解胶体几丁质主要产生(GlcNAc)2，并且在反应结束时形成的(GlcNAc)2进一步转化为GlcNAc。
从粉末甲壳素转化GlcNAc
评估了酶混合物从甲壳素生产GlcNAc的能力。通过扫描电子显微镜（SEM）观察粉末甲壳素在酶降解过程中的形态变化。粉末甲壳素呈大颗粒状，结构粗糙致密。单独使用mPbChi70处理不会导致粉末甲壳素结构发生明显变化。然而，双酶混合物的处理显着破坏了粉末甲壳素颗粒，并观察到大量碎片。此外，双酶混合物处理显着降低了结晶度指数(CrI)，从70.9%降至56.1%。
分别通过mPbChi70和双酶混合物对粉末甲壳素进行GlcNAc生物转化。当粉末甲壳素单独用mPbChi70水解时，转化率为18.34%（产物主要为GlcNAc和(GlcNAc)2）（图5a）。双酶混合物的应用显着提高了转化率，24小时时转化率高达71.9%（w/w），GlcNAc含量为7.19 mg/mL（图5b）。GlcNAc是水解产物中唯一的主要产物，其纯度高达95%（图5c）。本研究利用黑曲霉共表达的mPbChi70和GlcNAcase组成的双酶系统直接水解粉末甲壳素生产GlcNAc，转化率最高达到71.9%（w/w）（图5b)。该方法具有转化率高、样品易操作、成本低、无需专用大型设备、实用性强等优点。本研究中获得的GlcNAc纯度高达95%(w/w)，无需纯化（图5c），甚至接近Sigma Co.Ltd.的商业GlcNAc（分析级，纯度≥96%）。因此，本研究中的策略在GlcNAc的商业生产中可能具有巨大的应用潜力。
DOI：10.1016/j.biortech.2023.130024
文章链接：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2023.130024