今天推送的文章發表在ACS Catalysis的“Enhancing Local Electric Fields Drives the Proton-Coupled Electron Transfer within Cytochrome P450 ReductasePrecursor”，通訊作者為廈門大學化學化工學院王斌舉教授。
細胞色素P450酶在生物合成和代謝轉化中起着關鍵作用。細胞色素P450還原酶(CPR)是P450單加氧酶激活氧的關鍵電子供體，但CPR中的電子傳遞機制在很大程度上是未知的。作者通過分子動力學(MD)和量子力學/分子力學(QM/MM)計算來闡明CPR的電子傳遞機制。首先FADH−到FMN的電子轉移是通過質子耦合電子轉移(PCET)機制發生的。Glu142通過雙水分子鍊将一個質子轉移到FMN，同時電子從FADH−轉移到FMN。FADH•到FMNH•的電子傳遞是Asp675介導的PCET過程：ser457協助質子從FADH轉移到Asp675，耦合了FADH•到FMNH•的電子傳遞。其中，雙質子化His180的局域電場在動力學和熱力學上都顯著增強了PCET反應。作者的研究強調了局域電場在促進酶促反應的生物電子傳遞方面的重要作用。
典型的p450催化循環激活氧，形成活性的氧化鐵(iv)卟啉π -自由基陽離子，稱為化合物I (CpdI)。氧激活通常需要兩個電子，由NAD(P)H通過氧化還原夥伴的連續電子轉移提供。CPR是微粒體細胞色素的主要氧化還原夥伴，通過nadph -細胞色素P450還原酶(CPR)途徑在P450電子傳遞過程中發揮作用。CPR是二黃素還原酶家族的初始成員，在單個多肽鍊中包含兩個輔因子-黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黃素單核苷酸(FMN)。NADPH 進入 CPR 的 FAD 結構域以促進氫轉移。随後，FAD接受并依次向FMN提供兩個電子。最後，完全還原的 FMN （FMNH–）依次向P450提供兩個電子，完成催化循環。
圖1：細胞色素P450還原酶中NADPH和FMN之間電子轉移過程的反應機制
在CPR中已經有了大量關于電子轉移的實驗研究，但激發反應的具體細節，特别是質子轉移通道和蛋白質環境對電子轉移的影響仍不清楚。作者進行了結合分子動力學(MD)模拟和混合量子力學/分子力學(QM/MM)模拟研究這些問題。作者以褐家鼠(PDB代碼:5urd)的晶體結構為基礎，研究了P450還原酶中氫離子從NADPH轉移到FAD的初始結構。MD模拟表明，NADPH的煙酰胺環疊加在FAD的異alloxazine環上，基于MD結果，作者通過QM/MM進行了單點能量計算。在QM/ mm優化的反應物配合物(RC)中，NADPH煙酰胺官能團的一個氫原子指向FAD的N5原子，其距離為2.14 Å，是氫化物轉移的理想鍵長且計算的活化能勢壘與實驗值一緻，氫化物轉移完成後，NADP+上的電荷增加到0.74。氫離子從NADPH到FAD的轉移可能涉及到氫原子轉移和電子轉移。
圖2 用QM/MM表示氫離子從NADPH轉移到FAD的相對能量分布圖
動力學實驗36,37表明，在FADH−toFMN的第一次電子轉移(ET)中，FMN接受1個電子，形成FMNH•。是以，這種ET過程可能與質子轉移耦合，可能通過質子耦合電子轉移(PCET)機制。為了研究FADH−到FMN的PCET過程，作者利用NADPH和FAD之間氫離子轉移的QM/ mm優化的産物結構建構了系統。由于Glu142是距離FMN N5位點最近的堿基殘基，是以在PCET過程中選擇将其質子化以提供質子。PROPKA分析表明His180在CPR還原狀态下的比值pKa為6.55，這意味着His180可能以中性或雙去質子形式存在。
圖3 提出了從FADH−到FADH−的PCET過程的QM/MM能量輪廓
從IC2開始，質子從質子化的Glu142轉移到FMN的N5，在兩個水分子(WAT1和WAT2)的促進下，同時驅動來自FADH−toFMN的電子轉移，導緻IC3中的FADH•和FMNH•。Mulliken種群分析顯示IC2中FADH的自旋密度為~ 0。在IC3中，FADH的自旋密度增加到0.99，表明電子從FADH−toFMN成功轉移。這種PCET過程導緻FMNH•和FADH•的形成。作者通過QM模型計算表明，FADH−toFMN的純電子轉移是吸熱的，吸熱量為3.88 kcal/mol，表明該過程在熱力學上是非常不利的。在PCET過程中，質子輸入可以提高FMN的氧化還原電位，進而促進FADH−toFMN的電子轉移。
為了評估His180質子化對PCET過程的影響，作者在IC2中使His180去質子化(導緻HID)，并進行了額外的QM/MM計算。從HIP中除去一個質子，将其轉化為HID後，PCET過程的能壘從12.4 kcal/mol(圖4A)顯著增加到19.9 kcal/mol(圖5A)，這一發現與實驗結果一緻。此外，産物IC3 '的能量比中間體IC2 '高11.6 kcal/mol，而圖4A中僅高0.46 kcal/mol。這表明去除His180的正電荷将使FADH−到FMN的PCET反應在動力學和熱力學上都不利。是以，作者提出帶正電的HIP180顯著促進了FADH−到FMN的電子轉移。
圖4 用于FADH− 到FMN與HID180殘基引發CPR反應的質子耦合電子轉移
大量的實驗和理論表明，外部電場或内在存在于某些催化劑中的内部電場可以用來有效地控制化學活性和選擇性。通過質子化作用，在其側鍊的咪唑環上增加一個正電荷，顯著改變PCET反應發生的靜電環境。作者通過QM/MM計算中的Mulliken電荷來檢測帶正電的HIP180的靜電影響，以評估His180的帶電側鍊與PCET反應複合物(包括FADH−、FMN、Glu142和橋接水分子)之間的互相作用能。
圖5 HIP180中帶電側鍊與(A) IC2、(B) TS3和(C) IC3中PCET反應配合物之間的靜電互相作用能。
與IC2相比，TS3和IC3中帶正電的咪唑環與PCET反應複合物的靜态互相作用更有利。在PCET反應中，電荷重新配置設定将負電荷從FADH−toGlu142轉移，從IC2轉移到IC3。PCET過程中His180的質子化使反應複合物帶負電荷靠近帶正電的咪唑環，使得TS3和IC3的靜電穩定(如圖6A和6C所示)。靜電互相作用分析與QM/MM結果一緻，表明His180的質子化使PCET能壘降低了7.5 kcal/mol，使反應的吸熱性質降低了11.1 kcal/mol。結果表明，質子化HIP180中帶電咪唑環的電場有利于反應，IC3中的靜電穩定性優于TS3。這就解釋了為什麼His180的質子化比反應勢壘更顯著地降低了PCET反應能。在IC3中形成FMNH•後，我們的MD模拟顯示Gly141的主鍊C O基團接近FMN，與FMNH•形成氫鍵。鑒于具有FADH•/FMNH•的雙電子還原CPR結構可能與四電子還原CPR結構具有相似的活性位點結構和蛋白質構象，我們随後基于褐家鼠(PDB ID: 5ure)的四電子還原CPR的晶體結構對FADH•到FMNH•的PCET過程進行了QM/MM研究。
圖6 PCET工藝從FADH•到FMNH•的QM/ MM能量分布圖
在QM/ mm優化的IC4中，FADH•的H1原子和Asp675的O原子之間有一個質子通道，由Ser457橋接(圖7B)。從IC4開始，質子從FADH•轉移到Asp675，在Ser457的輔助下，促進電子向FMNH•轉移，産生FAD和FMNH−inIC5(圖7A)。這一過程遇到了一個約11.7 kcal/mol的能壘。CPR完全還原狀态下His180的預測值pKa為7.4，表明His180仍處于雙質子化狀态。
為了進行比較，使用QM/MM計算分析了從FADH•到FMNH•的PCET過程，其中His180為中性形式(HID180)。在此條件下，計算得到的能壘上升到15.1 kcal/mol，産物IC6′比中間産物IC4′的能壘高6.7 kcal/mol.以上結果表明雙質子化His180上的正電荷也促進了PCET從FADH•到FMNH•的過程，類似于FADH−toFMN的PCET過程。
總結：
作者通過廣泛的MD模拟和QM/MM計算，研究了CPR中的啟動反應。作者的模拟結果如下:
(1) NADPH向FAD的轉移是通過氫原子轉移反應和電子轉移發生的。
(II)來自FADH−到FMN的電子轉移是通過PCET機制進行的，其中Glu142通過兩個分子的水鍊将一個質子轉移到FMN，而FADH−同時轉移一個電子，形成FADH•/ FMNH•自由基。
(III)随後從FADH•到FMNH•的ET涉及Asp675介導的PCET, ser457輔助質子從FADH•轉移到Asp675，再加上電子轉移，導緻FAD和FMNH−。
(IV) His180的質子化态顯著影響FADH−toFMN的質子耦合電子轉移。