今天推送的文章发表在ACS Catalysis的“Enhancing Local Electric Fields Drives the Proton-Coupled Electron Transfer within Cytochrome P450 ReductasePrecursor”，通讯作者为厦门大学化学化工学院王斌举教授。
细胞色素P450酶在生物合成和代谢转化中起着关键作用。细胞色素P450还原酶(CPR)是P450单加氧酶激活氧的关键电子供体，但CPR中的电子传递机制在很大程度上是未知的。作者通过分子动力学(MD)和量子力学/分子力学(QM/MM)计算来阐明CPR的电子传递机制。首先FADH−到FMN的电子转移是通过质子耦合电子转移(PCET)机制发生的。Glu142通过双水分子链将一个质子转移到FMN，同时电子从FADH−转移到FMN。FADH•到FMNH•的电子传递是Asp675介导的PCET过程：ser457协助质子从FADH转移到Asp675，耦合了FADH•到FMNH•的电子传递。其中，双质子化His180的局域电场在动力学和热力学上都显著增强了PCET反应。作者的研究强调了局域电场在促进酶促反应的生物电子传递方面的重要作用。
典型的p450催化循环激活氧，形成活性的氧化铁(iv)卟啉π -自由基阳离子，称为化合物I (CpdI)。氧激活通常需要两个电子，由NAD(P)H通过氧化还原伙伴的连续电子转移提供。CPR是微粒体细胞色素的主要氧化还原伙伴，通过nadph -细胞色素P450还原酶(CPR)途径在P450电子传递过程中发挥作用。CPR是二黄素还原酶家族的初始成员，在单个多肽链中包含两个辅因子-黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黄素单核苷酸(FMN)。NADPH 进入 CPR 的 FAD 结构域以促进氢转移。随后，FAD接受并依次向FMN提供两个电子。最后，完全还原的 FMN （FMNH–）依次向P450提供两个电子，完成催化循环。
图1：细胞色素P450还原酶中NADPH和FMN之间电子转移过程的反应机制
在CPR中已经有了大量关于电子转移的实验研究，但激发反应的具体细节，特别是质子转移通道和蛋白质环境对电子转移的影响仍不清楚。作者进行了结合分子动力学(MD)模拟和混合量子力学/分子力学(QM/MM)模拟研究这些问题。作者以褐家鼠(PDB代码:5urd)的晶体结构为基础，研究了P450还原酶中氢离子从NADPH转移到FAD的初始结构。MD模拟表明，NADPH的烟酰胺环叠加在FAD的异alloxazine环上，基于MD结果，作者通过QM/MM进行了单点能量计算。在QM/ mm优化的反应物配合物(RC)中，NADPH烟酰胺官能团的一个氢原子指向FAD的N5原子，其距离为2.14 Å，是氢化物转移的理想键长且计算的活化能势垒与实验值一致，氢化物转移完成后，NADP+上的电荷增加到0.74。氢离子从NADPH到FAD的转移可能涉及到氢原子转移和电子转移。
图2 用QM/MM表示氢离子从NADPH转移到FAD的相对能量分布图
动力学实验36,37表明，在FADH−toFMN的第一次电子转移(ET)中，FMN接受1个电子，形成FMNH•。因此，这种ET过程可能与质子转移耦合，可能通过质子耦合电子转移(PCET)机制。为了研究FADH−到FMN的PCET过程，作者利用NADPH和FAD之间氢离子转移的QM/ mm优化的产物结构构建了系统。由于Glu142是距离FMN N5位点最近的碱基残基，因此在PCET过程中选择将其质子化以提供质子。PROPKA分析表明His180在CPR还原状态下的比值pKa为6.55，这意味着His180可能以中性或双去质子形式存在。
图3 提出了从FADH−到FADH−的PCET过程的QM/MM能量轮廓
从IC2开始，质子从质子化的Glu142转移到FMN的N5，在两个水分子(WAT1和WAT2)的促进下，同时驱动来自FADH−toFMN的电子转移，导致IC3中的FADH•和FMNH•。Mulliken种群分析显示IC2中FADH的自旋密度为~ 0。在IC3中，FADH的自旋密度增加到0.99，表明电子从FADH−toFMN成功转移。这种PCET过程导致FMNH•和FADH•的形成。作者通过QM模型计算表明，FADH−toFMN的纯电子转移是吸热的，吸热量为3.88 kcal/mol，表明该过程在热力学上是非常不利的。在PCET过程中，质子输入可以提高FMN的氧化还原电位，从而促进FADH−toFMN的电子转移。
为了评估His180质子化对PCET过程的影响，作者在IC2中使His180去质子化(导致HID)，并进行了额外的QM/MM计算。从HIP中除去一个质子，将其转化为HID后，PCET过程的能垒从12.4 kcal/mol(图4A)显著增加到19.9 kcal/mol(图5A)，这一发现与实验结果一致。此外，产物IC3 '的能量比中间体IC2 '高11.6 kcal/mol，而图4A中仅高0.46 kcal/mol。这表明去除His180的正电荷将使FADH−到FMN的PCET反应在动力学和热力学上都不利。因此，作者提出带正电的HIP180显著促进了FADH−到FMN的电子转移。
图4 用于FADH− 到FMN与HID180残基引发CPR反应的质子耦合电子转移
大量的实验和理论表明，外部电场或内在存在于某些催化剂中的内部电场可以用来有效地控制化学活性和选择性。通过质子化作用，在其侧链的咪唑环上增加一个正电荷，显著改变PCET反应发生的静电环境。作者通过QM/MM计算中的Mulliken电荷来检测带正电的HIP180的静电影响，以评估His180的带电侧链与PCET反应复合物(包括FADH−、FMN、Glu142和桥接水分子)之间的相互作用能。
图5 HIP180中带电侧链与(A) IC2、(B) TS3和(C) IC3中PCET反应配合物之间的静电相互作用能。
与IC2相比，TS3和IC3中带正电的咪唑环与PCET反应复合物的静态相互作用更有利。在PCET反应中，电荷重新分配将负电荷从FADH−toGlu142转移，从IC2转移到IC3。PCET过程中His180的质子化使反应复合物带负电荷靠近带正电的咪唑环，使得TS3和IC3的静电稳定(如图6A和6C所示)。静电相互作用分析与QM/MM结果一致，表明His180的质子化使PCET能垒降低了7.5 kcal/mol，使反应的吸热性质降低了11.1 kcal/mol。结果表明，质子化HIP180中带电咪唑环的电场有利于反应，IC3中的静电稳定性优于TS3。这就解释了为什么His180的质子化比反应势垒更显著地降低了PCET反应能。在IC3中形成FMNH•后，我们的MD模拟显示Gly141的主链C O基团接近FMN，与FMNH•形成氢键。鉴于具有FADH•/FMNH•的双电子还原CPR结构可能与四电子还原CPR结构具有相似的活性位点结构和蛋白质构象，我们随后基于褐家鼠(PDB ID: 5ure)的四电子还原CPR的晶体结构对FADH•到FMNH•的PCET过程进行了QM/MM研究。
图6 PCET工艺从FADH•到FMNH•的QM/ MM能量分布图
在QM/ mm优化的IC4中，FADH•的H1原子和Asp675的O原子之间有一个质子通道，由Ser457桥接(图7B)。从IC4开始，质子从FADH•转移到Asp675，在Ser457的辅助下，促进电子向FMNH•转移，产生FAD和FMNH−inIC5(图7A)。这一过程遇到了一个约11.7 kcal/mol的能垒。CPR完全还原状态下His180的预测值pKa为7.4，表明His180仍处于双质子化状态。
为了进行比较，使用QM/MM计算分析了从FADH•到FMNH•的PCET过程，其中His180为中性形式(HID180)。在此条件下，计算得到的能垒上升到15.1 kcal/mol，产物IC6′比中间产物IC4′的能垒高6.7 kcal/mol.以上结果表明双质子化His180上的正电荷也促进了PCET从FADH•到FMNH•的过程，类似于FADH−toFMN的PCET过程。
总结：
作者通过广泛的MD模拟和QM/MM计算，研究了CPR中的启动反应。作者的模拟结果如下:
(1) NADPH向FAD的转移是通过氢原子转移反应和电子转移发生的。
(II)来自FADH−到FMN的电子转移是通过PCET机制进行的，其中Glu142通过两个分子的水链将一个质子转移到FMN，而FADH−同时转移一个电子，形成FADH•/ FMNH•自由基。
(III)随后从FADH•到FMNH•的ET涉及Asp675介导的PCET, ser457辅助质子从FADH•转移到Asp675，再加上电子转移，导致FAD和FMNH−。
(IV) His180的质子化态显著影响FADH−toFMN的质子耦合电子转移。