4月19日，國際學術期刊ACS Sustainable Chemistry & Engineering線上發表了中國科學院分子植物科學卓越創新中心王勇研究組完成的題為“Design and optimization for efficient production of (S)-canadine in Escherichia coli”的研究論文。該研究首次實作了(S)-四氫小檗堿在大腸杆菌中的高效合成，為手性藥物的微生物合成提供了參考。
研究背景
Research background
(S)-四氫小檗堿是一種具備降糖、降脂和抗氧化等多種活性的原小檗堿類化合物，也是合成小檗堿（抗菌藥）和諾斯卡品（抗惡性良性腫瘤藥）的關鍵前體，在藥物研發方面具有巨大的潛力。現階段，(S)-四氫小檗堿可通過植物提取或化學半合成的方式獲得。然而，毛茛目植物根莖中(S)-四氫小檗堿的含量低以及化學合成的立體選擇性差等因素，限制了其大規模生産。微生物制造在手性化合物的合成方面獨具優勢，是合成此類高價值産品的重要技術手段。目前，微生物體系中已能高效合成苄基異喹啉生物堿的共同前體(S)-網狀番荔枝堿，但是受限于部分膜蛋白的非功能性表達，還未能實作(S)-四氫小檗堿的高效率從頭合成。
研究内容
Research content
本研究首先利用CRISPR-Cas9技術建構了一個高産酪氨酸的大腸杆菌底盤SQZB18，搖瓶培養2天後可積累2.11 g/L的酪氨酸（圖1）。随後，研究者發現四氫生物喋呤循環途徑整合至基因組前後，過表達大鼠和果蠅來源酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase, TYH）的菌株中(S)-網狀番荔枝堿的合成趨勢發生逆轉。結合酪胺的結構特征及體内飼喂實驗的結果，推測并證明了酪胺對RnTYHWR的抑制作用（圖2）。研究者後續巧妙地利用EcHpaBC-D11将酪胺轉化為多巴胺，解除了酪胺的抑制作用，并通過過表達嘌呤核酸磷酸化酶，獲得了菌株SQZ227，經兩天的搖瓶培養能産生100.13 mg/L的(S)-網狀番荔枝堿（圖3）。為了克服小檗堿橋酶（Berberine bridge enzyme, BBE）和四氫小檗堿合成酶（Canadine synthase, CAS）功能性表達的難題，研究者将篩選到的薊罂粟（Argemone mexicana L.）來源的小檗堿橋酶（AmBBE1）進行同源模組化和分子對接，得到98%轉化率的突變體AmBBE1F398W-I431F；另外，在優化CAS可溶性表達的基礎上，借助蛋白-肽互相作用結構域（SH3）和其配體（SH3-lig），最終從不同CAS來源的組合中篩選到支架結構的trCjCAS-AtCPR2，體外條件下能将32%的底物轉化為小檗堿（圖4）。在此基礎上，結合改善膜蛋白表達效率的效應因子（RraA）和細胞色素b5，研究者得到了表現最佳的(S)-四氫小檗堿産生菌SQZ266，該菌株在搖瓶培養下的産量達到16.81 mg/L，在反應器發酵條件下産量達到165.74 mg/L（圖5），是目前報道微生物從頭合成原小檗堿的最高水準。該研究不僅提供了生物堿高效微生物底盤的設計思路，也為生物堿的綠色和可持續生産奠定了基礎。
圖 1. (a) 酪氨酸高産菌株建構示意圖（b）工程菌株的酪氨酸滴度和生物量
圖 2. (a) BH4供應途徑和TYH來源對(S)-網狀番荔枝堿産量的影響 (b) BH4循環途徑和DDC對TYH s活性的影響 (c) 酪胺對RnTYH 活性的影響
圖 3. (a) 政策示意圖 (b) 改善多巴胺的代謝流量 (c) 影響(S)-網狀番荔枝堿産量的靶點
圖 4. (a) AmBBE1的分子對接和突變體的體外活性測試結果 (b) CAS和CPR空間分布對CAS活性的影響
圖 5. (a) 組合優化的元件和改善膜蛋白效率對(S)-四氫小檗堿産量的影響 (b) 菌株SQZ266的補料分批發酵結果
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中國科學院分子植物科學卓越創新中心王勇研究組博士研究所學生張前為論文的第一作者，王勇研究組的博士研究所學生吳宇函參與了相關工作。該研究得到國家重點研發計劃、上海市學術帶頭人計劃、國家自然科學基金、中國科學院先導項目及植物分子遺傳國家重點實驗室的資助。
王勇研究組合影
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