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蛋白質翻譯後修飾調節蛋白質功能，對生物學和疾病研究具有重要意義。科研工作者一直在不斷深入探索蛋白質翻譯後修飾的領域，其中包括磷酸化、泛素化、乙酰化等多種類型。在前幾篇推文中，小遠已經向大家介紹了一些常見的蛋白質翻譯後修飾類型，包括磷酸化和泛素化。如果你對這些修飾類型感興趣，不妨點選檢視詳細資訊哦！“蛋白翻譯後修飾——泛素化、蛋白翻譯後修飾——泛素化（二）、蛋白翻譯後修飾——磷酸化（一）、蛋白翻譯後修飾——磷酸化（二）”。今天，小遠将為大家帶來的是另一個備受矚目的“嘉賓”——乙酰化修飾。讓我們緊跟小遠的腳步，一同去探索乙酰化的奧秘吧！
一、蛋白質乙酰化修飾背景介紹
1、乙酰化
蛋白質乙酰化（Acetylation）是一種在真核生物和原核生物中都廣泛存在的翻譯後修飾類型，也是最為常見的一種酰化修飾類型。乙酰化是指蛋白在乙酰基轉移酶或非生物催化劑的催化下，将乙酰基團轉移并添加在蛋白N端或蛋白賴氨酸殘基上的過程，在調節蛋白質功能方面起着重要的作用。
蛋白N端乙酰化修飾大部分發生在真核生物中，由N端乙酰轉移酶（N-acetyltransferases, NATS）催化，目前還沒有發現N端去乙酰化酶，是以認為N端乙酰化是不可逆的(王旭初等, 2022)；賴氨酸上的乙酰化修飾在真核生物及原核生物中均廣泛存在，主要由賴氨酸乙酰轉移酶（lysine acetyltransferases, KATs）和賴氨酸去乙酰化酶（lysine deacetylases, KDACs）催化，是一個可逆的過程。
圖1 賴氨酸乙酰化可逆反應示意圖(Wang et al., 2020)。
2、N端乙酰轉移酶
N端乙酰轉移酶屬于GNAT（Gcn5-related N-acetyltransferase）蛋白家族，根據其底物特性和亞基組成，可以分為NatA、NatB、NatC、NatD、NatE、NatF和NatG等多個亞型，其中NatA、NatB和NatC主要作用于蛋白質N端，通常由一個催化亞基和一個或兩個輔助亞基組成。
圖2 真核生物中不同類型的NATs(Aksnes et al., 2016)。
3、賴氨酸乙酰轉移酶
賴氨酸乙酰轉移酶可以分為三個蛋白家族：GNAT家族，其中包括KAT2A和KAT2B；MYST家族，其中包括MOZ、Ybf2/Sas3、Sas2和Tip60；以及CBP/p300家族。KAT2A和KAT2B是GNAT家族中高度同源的乙酰轉移酶，有研究表明，它們在染色質修飾複合物中互相排斥(Nagy et al., 2010; Foumier et al., 2016)。Tip60作為MYST家族中研究最多的KAT，不僅在轉錄調控中起着重要作用，而且在DNA損傷修複過程中同樣起着重要的作用(張赫等, 2015)。CBP/p300乙酰轉移酶被認為是轉錄調控過程中發揮重要作用的轉錄共激活因子(Robert G. Roeder, 2019)。
4、賴氨酸去乙酰化酶
賴氨酸去乙酰化酶根據發揮功能的輔因子不同可以分為兩個家族：依賴Zn2+促進去乙酰化的蛋白家族和依賴NAD+促進去乙酰化的蛋白家族(呂斌娜等, 2015)。Zn2+依賴型蛋白家族在二級結構上與Hda1/Rpd3蛋白相似，這類蛋白僅表現出去乙酰化酶的活性；NAD+依賴型蛋白家族則與Sir2蛋白相似，這類蛋白除了可作為賴氨酸去乙酰化酶，還表現出ADP核糖基轉移酶活性(Barneda-Zahonero and Parra, 2012)。
二、蛋白質乙酰化檢測方法
乙酰化檢測是鑒定蛋白乙酰化、乙酰化位點及乙酰化水準的重要技術手段，常用的方法有質譜檢測法、免疫印記法及染色質免疫沉澱檢測法等。
1、質譜檢測法
利用質譜儀對蛋白質樣品進行分析，可以鑒定乙酰化蛋白質和乙酰化位點。這種方法具有高靈敏度和高特異性，能夠全面分析乙酰化修飾，但對于乙酰化水準的定量分析相對較為困難。大緻流程可分為總蛋白提取、蛋白酶解、乙酰化肽段富集、質譜上機及資料分析這5個步驟。
2022年9月，華中農業大學郭文武課題組在Plant Physiology雜志上發表了一篇題為“Acetylome reprograming participates in the establishment of fruit metabolism during polyploidization in citrus”的研究論文。作者使用質譜檢測技術，對柑橘異源四倍體雜種及其雙親果肉組織進行了分析。研究發現，大量非組蛋白類蛋白被鑒定存在乙酰化修飾，共鑒定出超過1600個蛋白的4000多個乙酰化位點。
圖3 柑橘果實中賴氨酸乙酰化酶特性研究(Zhang et al., 2022)。（A）用于乙酰化分析的柑橘果肉（汁囊），比例尺=1厘米；（B）用抗乙酰賴氨酸(anti-KAc)抗體對果肉中賴氨酸乙酰化蛋白的免疫印迹分析（左），考馬斯亮藍染色為對照（右）；（C）柑橘、拟南芥5周齡植物葉片、水稻14日齡幼苗葉片賴氨酸乙酰化（KAc）位點和乙酰化蛋白質數量。其中拟南芥和水稻中資料分别來自于(Hartl et al., 2017)和(Zhou et al., 2018);（D）柑橘與拟南芥和水稻之間每個乙酰化蛋白的乙酰化位點比較；（E）柑橘和拟南芥不同代謝途徑中每個乙酰化蛋白的乙酰化位點比較；（F）含有乙酰化賴氨酸殘基的蛋白質在柑橘果實中預測的亞細胞定位分布；（G）維恩圖顯示了來自柑橘、拟南芥和水稻的同源乙酰化蛋白之間的重疊；（H）對柑橘特異乙酰化蛋白進行KEGG富集分析。
2、免疫印記法
免疫印迹法（Western blot, WB）又稱蛋白免疫技術，其利用抗原抗體特異性結合的原理對乙酰化蛋白進行檢測，先将蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然後将分離産物轉移到固相載體上與一抗結合，再将其與特定标記的二抗進行免疫反應，通過放射自顯影等方法進行檢測。
2023年11月，青島農業大學梁文星課題組在New Phytologist雜志上發表了一篇題為“Sir2-mediated cytoplasmic deacetylation facilitates pathogenic fungi infection in host plants”的研究論文。該研究揭示了尖孢鐮刀菌通過細胞質蛋白乙酰化調控病原菌緻病性的新機制，作者利用亞細胞定位和乙酰化修飾免疫印迹檢測，在尖孢鐮刀菌番茄專化型（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, Fol）中鑒定出了一個定位于細胞質的去乙酰化酶FolSir2，并發現敲除體ΔFolSir2緻病力顯著下降。
圖4 FolSir2對于Fol真菌去乙酰化以及緻病性至關重要(Zhang et al., 2023)。（a）建立FolSir2與同源人類Sirtuin亞型（SIRT1-7）之間的系統發育樹；（b）野生型（WT）、敲除體ΔFolSir2和回補株ΔFolSir2-C賴氨酸乙酰化免疫印迹分析，考馬斯亮藍染色為對照，以確定每條泳道上的蛋白質載量相等，展示的每一種凝膠都進行了三次重複實驗；（c）組蛋白H3和H4乙酰化的免疫印迹分析；（d）在感染14天後，對Fol菌株在番茄上的緻病性進行評估。
3、染色質免疫沉澱檢測法
染色質免疫沉澱（Chromatin immunoprecipitation, ChIP）技術是研究體内DNA與蛋白質互相作用的方法。利用特異性的抗體，可以選擇性地富集特定的DNA結合蛋白及其靶标位點，可用于研究基因組中已知靶标位點上的組蛋白修飾和/或蛋白結合情況。整個實驗流程大緻可以分為交聯、染色質片段化、免疫沉澱、解交聯、DNA提取及資料分析這幾個過程。
2022年5月，華中農業大學黃俊斌課題組在Nucleic Acids Research雜志上發表了一篇題為“A secreted fungal effector suppresses rice immunity through host histone hypoacetylation”的研究論文。該研究從表觀遺傳水準揭示了稻曲菌效應蛋白操縱水稻組蛋白去乙酰化抑制寄主免疫的新機制。作者在研究中利用ChIP-seq鑒定發現35S-UvSec117轉基因水稻中H3K9乙酰化修飾調控的靶基因數量顯著減少，結合RT-qPCR和ChIP-qPCR證明了35S-UvSec117轉基因水稻中H3K9乙酰化修飾調控的抗病相關基因表達量顯著降低。
圖5 稻曲菌效應蛋白UvSec117操縱水稻組蛋白去乙酰化酶 OsHDA701 抑制水稻免疫(Chen et al., 2022)。（a）左圖：對35S-EV和35S-UvSec117轉基因株系在接種稻瘟病菌HWD-2 25天後的抗性測定。右圖：在抗性測定中測量到的稻瘟病菌平均數量；（b）左圖：35S-EV和35S-UvSec117轉基因株系感染稻瘟病菌11天後葉片上的病害症狀。右圖：稻瘟病菌Pot2的相對真菌生物量用RT-qPCR檢測；（c）左圖：接種水稻白葉枯病菌PXO99A的35S-EV和35S-UvSec117轉基因株系21天後的葉片症狀和長度（右圖）；（d）免疫印迹法檢測35S-EV和35S-UvSec117轉基因株系中組蛋白H3K9ac、H3K27ac、H3K36ac、H3K56ac、H4K5ac、H4K8ac、H4K12ac和H4K16ac的表達水準；（e）在轉錄起始位點（TSS）中識别出H3K9ac峰，TSS上遊2kb和轉錄終止位點（TES）下遊2kb DNA區域中讀數的統計重疊分布；（f）對接種稻瘟病菌HWD-2 1天後的35S-EV和35S-UvSec117轉基因株系中防禦相關基因進行RT-qPCR分析；（g）ChIP-qPCR分析35S-EV和35S-UvSec117轉基因株系在接種病菌1天後的防禦相關基因。
蛋白質乙酰化作為一種重要的蛋白質修飾方式，在細胞功能和信号轉導中發揮着關鍵的作用。為了更全面地研究蛋白質乙酰化的功能和機制，我們可以運用多種方法進行探究。在上文的方法介紹中，小遠隻是重點突出了所要講述的技術，但是統觀整篇文章，作者會同時使用多種探究方法，感興趣的小夥伴可以自行學習。
上述三種方法是目前應用較為廣泛的方法，但小遠還聽說高通量蛋白質組學、化學生物學以及生物資訊學等領域正在不斷發展，有望對蛋白質乙酰化修飾的解析提供巨大的幫助，期待值已經被拉滿。
三、蛋白質乙酰化修飾在植物中的功能
蛋白質乙酰化修飾參與生物體生理和疾病相關的關鍵過程，如基因轉錄、DNA損傷修複、細胞分裂、信号轉導、蛋白質折疊、自噬和代謝。在植物個體層面，蛋白質乙酰化又發揮了什麼樣的功能呢？
1、參與植物免疫應答反應
病原菌效應蛋白與植物之間的互相作用機制一直是植物領域的研究熱點，然而，對于它們如何激活植物免疫的機制仍存在一些待解的謎題。2021年11月，南韓浦項科技大學Kee Hoon Soh課題組在Molecular Plant雜志上發表了一篇題為“Direct acetylation of a conserved threonine of RIN4 by the bacterial effector HopZ5 or AvrBsT activates RPM1-dependent immunity in Arabidopsis”的研究論文。揭示了病原菌效應蛋白HopZ5和AvrBsT通過乙酰化修飾RIN4（RPM1-INTERACTING PROTEIN4）來激活植物免疫的新機制。
已有研究表明拟南芥去乙酰化酶SOBER1能抑制效應蛋白HopZ5和AvrBsT激發的植物免疫反應。在本研究中作者發現在缺乏SOBER1的情況下，這兩個病原菌效應蛋白激活的免疫反應依賴于RIN4和細胞内的抗病蛋白RPM1。作者通過選取拟南芥SOBER1功能缺失突變體sober1-3，簡稱為sober1，來進行乙酰轉移酶效應蛋白觸發超敏反應（hypersensitivity reaction, HR）的依賴性驗證。攜帶效應蛋白HopZ5或AvrBsT的Pto DC3000病原菌在sober1 rpm1和sober1 rps2 rin4突變體中的生長與攜帶空載的Pto DC3000菌株相當，但與sober1 rps2突變體中的不同，這表明在拟南芥中，HopZ5或AvrBsT觸發的免疫需要RPM1和RIN4，而不是RPS2。綜上所述，細菌乙酰轉移酶HopZ5和AvrBsT可能靶向RIN4，激活RPM1依賴性免疫。
圖6 細菌乙酰轉移酶效應蛋白HopZ5和AvrBsT觸發拟南芥中RPM1和RIN4依賴性免疫(Choi et al., 2021)。
有其它的研究表明，另外兩個效應蛋白AvrB和AvrRpm1能通過胞質類受體激酶RIPK，誘導RIN4第166位蘇氨酸（T166）的磷酸化并激活RPM1依賴的免疫反應。是以，作者進一步研究了HopZ5和AvrBsT同RIN4的互作關系。
通過免疫共沉澱實驗，研究人員發現HopZ5和AvrBsT與RIN4之間存在互相作用（圖7A）。有趣的是，通過體外反應和質譜鑒定，研究人員發現作為乙酰化酶的HopZ5和AvrBsT能夠對RIN4的保守位點T166進行乙酰化修飾（圖7B、C）。這種乙酰化修飾不僅在體外反應中存在，在植物體内和病原菌侵染過程中也存在（圖7D、E）。最終，RIN4 T166位點的乙酰化修飾将激活RPM1依賴的免疫反應，進而使植物能夠抵禦病原菌的侵襲，并展示出抗病性。
圖7 HopZ5和AvrBsT與RIN4互相作用并乙酰化RIN4(Choi et al., 2021)。（A）HopZ5和AvrBsT與RIN4互相作用，無論它們的催化活性如何；（B）乙酰化RIN4片段肽（FGDWDENNPSSADGYTHIFNK）與HopZ5-FLAG蛋白孵育後的MS/MS譜；（C）HopZ5和AvrBsT乙酰化RIN4的體外研究；（D）HopZ5和AvrBsT乙酰化N. benthamiana.中的RIN4的T166位點；（E）在拟南芥中，HopZ5乙酰化T166 RIN4。
這項研究的結果表明，HopZ5和AvrBsT通過直接乙酰化RIN4蛋白激活RPM1依賴的免疫反應。這揭示了一種新的機制，即通過乙酰化修飾調控植物免疫反應。這項研究的發現對于深入了解植物與病原菌的互相作用、揭示免疫信号轉導的機制以及開發抗病技術具有重要意義。
2、參與植物脅迫反應
蛋白質乙酰化在植物逆境脅迫中發揮着重要的調控作用，通過調節蛋白質的活性、穩定性和基因表達等方面，幫助植物适應逆境環境并提高抵抗逆境的能力。深入研究蛋白質乙酰化與植物逆境脅迫的關系，有助于我們了解植物逆境适應機制，并為培育逆境耐受性農作物提供理論基礎。
2022年1月，中國科學院分子植物科學卓越創新中心張蘅課題組在Stress Biology雜志上發表了一篇文章題為“Acetylproteomics analyses reveal critical features of lysine-ε-acetylation in Arabidopsis and a role of 14-3-3 protein acetylation in alkaline response”的研究論文，解析了拟南芥主要器官的蛋白質乙酰化，分析了植物賴氨酸乙酰化的關鍵特征，并揭示了14-3-3蛋白乙酰化在植物堿脅迫應答中的重要作用。
在這項研究中，作者使用高分辨率串聯質譜儀對包括拟南芥的葉、根、莖、花和種子在内的五個具有代表性的植物器官進行了賴氨酸乙酰化分析，共鑒定到2887個Kac（Lysine-ε-acetylation）蛋白和5929個Kac位點。進化分析發現，Kac會優先靶向進化上保守的蛋白質和保守的賴氨酸。
作者觀察到許多Kac蛋白質同時也會受到其他翻譯後修飾（如磷酸化、泛素化、SUMO化）的調控，盡管乙酰化、泛素化和SUMO化都能修飾賴氨酸殘基，但它們很少在相同的位點上發生修飾。被乙酰化和磷酸化共同靶向的蛋白質通常富含許多溴結構域和14-3-3蛋白結構域。結構分析顯示，14-3-3蛋白結合磷酸化修飾底物的結合位點處的第56位賴氨酸乙酰化（K56ac）可能阻斷其與磷酸化底物的結合（圖8A）。之前的研究表明磷酸化識别蛋白14-3-3s參與質膜H+-ATPase AHA2活性的調節，同時14-3-3s與AHA2之間的互相作用會受到14-3-3s蛋白自身翻譯後修飾的調控。
圖8 GRF6中的Lys56乙酰化負向調節拟南芥的耐堿性(Guo et al., 2022)。（A）基于Cp14-3-3的預測模型顯示了GRF6結構。在放大圖（頂部）中标示了含有3個帶正電的殘基（K56、R63和R136）的磷酸化絲氨酸（pSer）結合口袋，并且用紅色标示出了已鑒定的乙酰化賴氨酸的側鍊（底部）；（B）免疫沉澱GRF6蛋白質和乙酰化水準的免疫印迹分析；（C）酵母試驗表明，當葡萄糖是唯一的碳源時，酵母的生長同時需要AtGRF6和AtAHA2。當半乳糖作為唯一碳源時，酵母的生長不依賴于AtGRF6和AHA2（左圖）；（D）甲基紫染色顯示AtAHA2和不同的AtGRF6表達對培養液pH值的影響；（E）酸堿度變化在（D）中的量化；（F）正常pH5.8和高pH8.2平闆上植物根的生長表型；（G）根長度在（F）中的量化。
為了進一步探索14-3-3蛋白乙酰化的生物學功能，作者開發了一個酵母外源表達系統進行驗證。在缺失内源14-3-3和H+-ATPase蛋白的酵母中，轉入了拟南芥AHA2和14-3-3蛋白GRF6，建構了乙酰化（K56Q）和去乙酰化（K56R）突變體（圖8C）。通過檢測酵母細胞外溶液的pH變化，結果表明GRF6中Lys56的乙酰化對AHA2的活性具有負調控作用。拟南芥的轉基因實驗也驗證了GRF6 Lys56的乙酰化在植物堿脅迫應答中的負調控作用（圖8D、E）。在grf6 grf8雙突變背景中，轉入GRF6 K56Q無法恢複植物在高pH環境下的正常生長，并且在高pH環境中GRF6的乙酰化水準降低（圖8F、G）。是以，該研究揭示了蛋白質乙酰化通過調節14-3-3蛋白與AHA2的互相作用來調節植物堿脅迫應答的新機制。
小遠叨叨
這篇文章介紹了乙酰化蛋白翻譯後修飾，首先為大家介紹了乙酰化修飾的背景知識，然後介紹了三種鑒定蛋白質乙酰化的方法，最後着重描述了乙酰化修飾在植物中的生物功能，但是由于篇幅有限，隻介紹了其中兩種功能，感興趣的小夥伴可以繼續深入挖掘。本篇文章是2023癸卯年的最後一篇文章，在此感謝大家2023年的陪伴和支援，也借此機會祝大家2024甲辰年，龍騰虎躍！龍行龘運！大展圖騰！
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