文丨無名灏
編輯丨無名灏
禾谷鐮刀菌是攻擊小麥植物并顯著降低全球小麥産量的毒性最強的病原體之一。
目前的工作旨在闡明兩種引發溶液（鈣（Ca）或水楊酸（SA）），與禾谷鐮刀菌接種之間的互相作用，這取決于小麥幼苗的生長速率、生理屬性和分子反應。
在盆栽實驗中，在蒸餾水、5-mMCaCl 2或0.05-mMSA中引發12小時後，使用預接種的禾谷鐮刀菌或無接種物的沙土使麥粒發芽。
結果表明，禾谷鐮刀菌接種降低了生長速度和葉綠素含量，但促進了類胡蘿蔔素、應激标記物（電解質滲漏、脂質過氧化、蛋白質氧化、過氧化氫和羟自由基）、抗氧化分子（AsA、酚類和類黃酮）、滲透劑（GB、氨基酸、和脯氨酸）和抗氧化酶（CAT、GPX、SOD、PPO和PAL）。
除了這些以外，真菌感染還增強了CAT、GR、PR4、MT和PCS基因的表達，然而将小麥籽粒預浸泡在Ca或SA溶液中有助于恢複生長速度、葉綠素含量和抗氧化能力，進而減輕真菌接種的負面影響。
它還可以減少誘導的氧化應激并下調禾谷鐮刀菌的基因表達-接種的小麥幼苗，通過最大限度地減少禾谷鐮刀菌侵染的負面影響，我們可以使用Ca或SA引發來适當刺激生長并重新調整小麥幼苗的氧化狀态。
脅迫帶來的影響
在氧化狀态的基礎上，當植物受到生物脅迫，這對農業部門産生影響并構成威脅，真菌感染是對作物生産和糧食安全的持續威脅。
其中鐮刀菌屬是小粒谷物中最常見的真菌感染之一，會造成廣泛的損害，赤黴病(FHB)、苗枯病和冠腐病、足褐腐病(FCFR)是由禾谷鐮刀菌引起的小麥最重要的病害。
是以氣候變化、耕作減少、作物輪作或将稭稈扔到田裡的習慣，可能導緻FHB病例增加，根據FHB嚴重性和真菌毒性，禾谷鐮刀菌被列為十大植物真菌病原體之一。
在小麥頭感染和定殖後，禾谷鐮刀菌會幹擾籽粒發育，并用黴菌毒素混合物污染幸存的籽粒，進而使它們不适合人類和飼料利用，進而損害小麥的整體産量。
最流行的鐮刀菌谷物中的黴菌毒素，包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、雪腐金鐮刀菌素和鐮刀菌素C，其中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是禾谷鐮刀菌污染最重要的毒力因子。
然而通過操縱細胞質鈣濃度，使植物發育和反應作為關鍵的參與者，其中植物已經開發出感覺、易位和響應各種生物和非生物刺激的有效機制。
但鈣(Ca 2+ )是一種多功能的内源性第二信使，可觸發多種反應，參與生長、防禦以及對多種信号通路中生物和非生物刺激的适應。
此外Ca 2+是細胞區室中受到嚴格調控的離子，其濃度的空間和時間控制使其成為植物中的多功能信号成分。
鈣離子還被證明，在植物細胞細胞壁和中層果膠多糖的交聯中發揮作用，增強它們并促進組織對抗真菌酶活性。
此外，植物激素在減少生物和環境壓力源的有害後果和作用已得到充分證明，水楊酸(SA)是植物激素之一，通過調節代謝和分子過程，在植物對各種刺激的反應中充當信号和調節分子。
是以種子發芽、氣孔關閉、離子吸收和運輸、膜滲透性、光合作用和植物發育都被證明受到外源應用SA的影響。
根據大量研究表明，SA是一種重要的苯基丙烷化合物，可調節植物對發病機制和其他脅迫條件的耐受性。
在植物中，當病原體遇到植物器官時，會發生系統獲得性抗性（SAR）現象，引起局部超敏反應，然後将信号傳輸到周圍的植物器官，防止額外的感染。
這些系統反應主要基于激素串擾和小分子互相作用，進而誘發廣譜耐藥現象，水楊酸介導的信号傳導觸發SAR。
水楊酸反應與發病機制相關蛋白(PRP)的表達相關，其中之一是PRP1，它是一種水楊酸标記物，在許多植物的SA反應過程中上調。
水并且楊酸是一種重要的植物防禦激素，可以幫助植物防禦多種生物營養和半生物營養生活方式的疾病。
病原體攻擊部位SA濃度升高可觸發H 2 O 2形成，導緻病原體感染部位發生過敏反應和植物細胞壁木質化，進而促進抗病性。
此外我們還發現SA的處理，是通過調節抗氧化途徑提高了小麥對禾谷鐮刀菌感染的抵抗力，進而增加了H 2 O 2濃度和促進病原體相關基因。
然而H2 O 2和SA水準之間的相關性證明了，這兩個信号在增強植物防禦方面的互相作用，因為它們與PRP的活性水準密切相關。
對于小麥的分子效應
小麥被列為2014年最基本的農産品，産量超過2.2億公頃，産量達7.3億噸。在許多地區，它被用作主要主食。
例如面包，并且被認為是人類營養中最豐富的膳食蛋白質來源，占全球膳食蛋白質總量的第五位。
除了蛋白質、碳水化合物和脂質的主要成分外，小麥籽粒還富含植物化學物質、維生素、抗氧化劑以及常量和微量營養素。
我們在先前的研究中，描述了甘氨酸甜菜堿、脯氨酸和遊離氨基酸等滲透劑分子，如何通過多種機制幫助植物應對入侵的微生物，
其中包括調節細胞滲透壓、ROS溶解、維持膜流動性和穩定細胞結構，根據對綜合的探索，目前尚不清楚SA到底如何發揮作用，以此來降低禾谷鐮刀菌對小麥的緻病性。
并且據我們所知，還沒有研究确定Ca在該病原體抗性中的作用，是以本研究的主要目标是探索Ca或SA的啟動，是否确實可以減輕接種禾谷鐮刀菌對小麥幼苗和産量的影響，
接下來我們将重點關注幼苗階段的生長速率、代謝活性、抗氧化狀态和分子反應性。
幼苗和真菌分離物
小麥籽粒購自埃及吉米薩的農業研究中心，并根據明顯的尺寸和形态同質性進行選擇，Assiut大學真菌學中心為本次研究提供了禾谷鐮刀菌Schwabe。
根據植物學家索比的說法，使用沙玉米粉（SCM）培養基将禾谷鐮刀菌孢子接種到土壤中。
真菌菌絲體在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基上生長7天後，将五個菌絲盤插入SCM培養基中，并在28°C下孵育3周。
播種麥粒前，将5克SCM培養基撒在預先洗淨的沙土中，并且放置兩天，當播種時，将小麥籽粒用5%Clorox ®外部消毒5分鐘，并用自來水沖洗多次，然後用去離子水漂洗。
根據初步研究結果，将消毒後的籽粒分為三組：第一組浸入蒸餾水中，第二組用5mMCaCl 2溶液灌注，第三組用0.05mM水楊酸溶液灌注。
12小時後，除去浸泡液，并用去離子水洗滌籽粒，每個籽粒組分為兩個亞組，其中一個亞多點傳播種于禾谷鐮刀菌中一種是預接種的沙土，另一種是預洗的無接種物的沙土。
在完全随機的設計中，将土壤封閉在裝有8公斤土壤的塑膠盆（直徑35厘米×深27厘米）中并進行六次處理。
其中在六次處理的完全随機設計中，土壤被限制在35×27厘米的塑膠盆中，每盆裝有8公斤沙子。
成苗後将盆修剪成均勻的10株/盆，每個處理重複5次，21天後收集幼苗以進行形态學、生物化學和分子學評估。
滲透保護分子
當評估進行完畢後，我們對小麥葉幹粉的水提取物中的季铵滲透劑甘氨酸甜菜堿(GB)進行定量。
先使用KI-I 2試劑和GB開發的标準，再使用酸茚三酮試劑和由脯氨酸建立的校準曲線測定小麥葉子的總遊離脯氨酸（TFP）含量。
按照研究的結果，使用甘氨酸作為标準品和茚三酮-檸檬酸鹽緩沖液-甘油試劑，通過分光光度法測量小麥葉提取物中的總氨基酸(TAA) 。
之後将新鮮小麥葉在液氮中勻漿，然後在磷酸鹽緩沖液（50mM，pH7.0）中提取，通過監測240nm處H2 O 2分解的初始速率，并使用消光系數(40mM -1 cm -1 )計算活性來測量過氧化氫酶(CAT)活性。
由于硝基藍四唑(NBT)光化學還原成甲臜而導緻560nm處的光吸收增加，并利用消光系數(21.1mM-1cm-1)來評估小麥中的超氧化物歧化酶(SOD)活性葉提取物。
在420nm處監測由于連苯三酚氧化成紅沒食子素而産生的顔色強度，并使用消光系數(26.4mM-1 cm -1 )計算多酚氧化酶(PPO)活性。
在苯丙氨酸作為底物存在的情況下，所得反式肉桂酸在290nm處的吸光度用于檢測苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性。
根據Wang等人的研究，使用反式肉桂酸(10.24mM -1 cm -1)的摩爾消光系數計算PAL活性。（2006）。所有測量的酶的活性均表示為μM.g -1 FMmin。
遵循實驗指南，我們從小麥幼苗中提取總RNA，再通過使用熱循環儀逆轉錄總體積20μL的RNA，使用逆轉錄酶(RT)生成互補DNA。
其中反應過程包括在40°C下進行60分鐘的酶激活循環，然後在95°C下進行第二個酶失活循環5分鐘。
上述步驟做完之後，我們再進行三次混合研究，包含所研究基因的引物對：過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)、發病機制相關2(PR2)、發病機制相關4(PR4)、金屬硫蛋白樣蛋白1(MT)或每個反應中均使用植物螯合素合酶(PCS)，并在延伸階段檢索資料。
在擴增過程中，初始解離階段在95°C10分鐘，随後是40個循環的95°C變性15秒，60°C退火30秒，以及72°C延伸30秒。
為了排除非特異性擴增子的存在，擷取了熔解曲線并使用β-肌動蛋白基因作為參考，再使用Livak開發的方法對所研究基因的相對表達進行量化和計算。
同時實驗結果表明，接種禾谷鐮刀菌或用Ca或SA引發，以及它們的聯合互相作用，顯着影響小麥幼苗的生長特性，如芽高、芽含水量、葉面積、根深和根系含水量。
與健康未感染對照相比，接種禾谷鐮刀菌明顯降低了小麥幼苗地上部的芽高、葉面積、根深和根相對含水量，但對地上部含水量沒有明顯影響。
與對照處理相比，用CaCl 2進行種子引發增加地上部高度和葉面積，不影響地上部含水量或根部深度，并略微降低小麥幼苗的根部含水量。
另一方面，與對照幼苗相比，SA處理的小麥幼苗的芽高、芽含水量或根深度沒有變化，根含水量略有下降，葉面積略有改善。
盡管真菌感染和引發處理（Ca或SA）的組合促進了芽和根的生長，但SA處理和禾谷鐮刀菌感染的小麥幼苗的葉面積比感染的幼苗顯示出更多的脅迫信号。
總體而言，在用Ca或SA溶液引發的植物中，禾谷鐮刀菌對小麥幼苗生長的影響比未引發感染，并且分子影響也呈逐漸降低驅使。