«——【·細胞外蛋白酶的功能和生理意義·】——»
近年來，酶在工業加工中的應用受到了相當大的關注，主要是由于對環境的關注，蛋白酶對自己已經占ca，全世界酶總銷售額的40%，蛋白酶确實是細胞生長和分化所必需的。
是以它們普遍存在于活的生物體中與糞藻熒光單胞藻、銅綠假單胞菌、蠟狀芽跑杆菌、地衣芽跑杆菌、扁豆芽抱杆菌、梭菌-sP。
嗜水氣單胞菌是迄今為止合成率最高的胞外蛋白酶，從生産的角度來看特别友善，而且在幾種bacil-lus屬中也觀察到了大量的生産力。
作為目前可獲得的大量商業蛋白酶的結果，也見證了不斷增長的用途組合。
然而越來越高的需求推動了全面篩選新菌株的努力，這些菌株可以産生具有更好特征的蛋白酶或易于開發更低成本/更高産量的工業過程。
例如來自球形芽抱杆菌的有機溶劑穩定的蛋白酶和從枯草芽跑杆菌的乳凝proease進行了描述。
然而我們的原生菌株似乎是相當不同的，是以任何更好的成就要求在其他地方和有關不同物種的不一定與我們的獨特菌株平行。
人們早就認識到，生物技術在工業中成功應用的一個主要障礙是酶生産和下遊純化的總成本40%的酶的最終成本實際上來自用于其來源發酵的培養基拉緊。
是以如果尋求經濟上可行的工藝，發酵的優化将承擔很大的相關性。
每個微生物實際上都有其特有的生長和酶合成/分泌的限制。
是以發現了獨特的理化和營養要求，除其他操作因素外，培養基的定性和定量圖譜也應針對每種微生物和所需的代謝物進行優化。
例如：細胞外蛋白酶的産生受到C/N比、易代謝糖和氮源的存在/缺失以及特定金屬離子的有效性等特性的強烈影響，而曝氣速率、接種密度、pH值、溫度和培養時間等處理條件也起着關鍵作用。
通過經典方法優化工藝參數“一次一個變量”的體積變化是非常耗費時間的。
是以當要考慮大量的變量時是昂貴的，盡管忽略了參數之間的互相作用，但這仍然是在微生物系統中獲得高産量酶的生物過程工程中最常用的政策。
特别是在工藝優化的早期階段，對實際影響en-酶的合成産率和速率，結果忽略互相處理互相作用的初步研究是可接受的。
隻是為了找到是否有一個因子，影響蛋白酶生産到一個sig，重要程度，進一步優化的最合理範圍，包括這些因素之間的互相作用，都是以而有序。
為了克服前面提到的“一時間一次”方法無法精确指出加工參數之間的互相作用，提出了階乘設計這些設計實際上經常用于篩選影響反應的。
當關鍵因素超過3個需要測試時，它們通常采用适當的分數形式，以避免需要進行大量的試驗。
是以本研究的主要目的是尋找最佳的加工因素組合，以提高羊毛相關的Ba-cillussp菌株HTS102的蛋白酶産量。
這是最近從葡萄牙本地綿羊品種中分離出的一種新菌株，它分泌出一種非常強而穩定的蛋白酶，具有角質分解特性。
在進行了幾項比較性的“單因素實時”研究之後，采用了2V6-L分數模糊設計，更好地闡明了與最有前途的加工參數相關的主要效應和雙因素互相作用。
并最終提高了該微器官的蛋白酶産率在某種程度上，這種主義足以支撐工業界最終的興趣。
«——【·通過“一次一個因素”的方法進行初步篩選·】——»
營養液培養基被用作對照;雖然這可能不是工業規模上最便宜的培養基，但其組成的穩定性被發現是技術重制性的決定因素，進而導緻我們選擇從廉價來源獲得的純媒體。
牛肉和酵母提取物，分别取代替代更便宜的碳和氟源，在同等濃度，測試的碳源為澱粉、甘油、乳糖、蔗糖、葡萄糖和果糖，考慮的氮源有蛋白陳、胰蛋白陳、氯化和硫酸。
為了找出芽孢杆菌産生蛋白酶的關鍵因素，對影響許多細菌産生蛋白酶的10個實體化學因素進行了試驗。
HTS102金屬離子濃度-10mMFeso01gL-Mgso接種密度、pH值是影響接種量的主要因素。
通過“一次移動一個組分”的方法制備了幾種培養基配方，以确定NB的每個組分對蛋白酶原的影響。
篩選出了影響芽抱杆菌産蛋白酶的6個關鍵因素，HTS102酵母水準提取物和蛋白酶，接種密度，攪拌速度，pH值和培養溫度通過2v部分析因，無重複設計進行了優化。
每個因素值的範圍是根據文獻中的資訊選擇的，再加上在試驗過程中獲得的經驗。
錐形瓶用1%的新鮮接種物0.60Donm接種，細胞外蛋白酶除非另有說明活性在37°C的36小時潛伏期後進行定量。
本研究所用的微生物是芽抱杆菌，超導102分離自葡萄牙Me-rino羊毛--并正式儲存在可公開擷取的文化收藏，來自比利時根特BCCMLMG細菌培養物收取。
用0.45um濾池過濾滅菌的無細胞上清液，在660nm處用比色法測定酪蛋白分解程度，采用Folin-Ciocalteu試劑進行蛋白酶活性測定。
蛋白質水解活性的一個機關是指能水解酪蛋白的酶量，使其在37°C的pH值為7.5時每分鐘産生的吸光度變化等于酪氨酸的1.0umol。
在整個36小時的培養期内，提取等分試樣，使用BCA在562nm處吸光度進行總蛋白測定，蛋白質測定試劑盒再根據供應商的訓示。
«——【·細胞外蛋白酶的碳源選擇·】——»
在測試的幾種碳源中，原始NB培養基配方産生的蛋白酶活性最高，蛋白酶的生産幾乎完全重新在葡萄糖存在下壓制。
是以碳源不作為優化因素，在考慮氮源的情況下，所有的測試無機和有機化合物似乎阻礙酶的生産，相對于使用平原對照組中觀察到的。
當用純蛋白陳代替酵母膏和蛋白陳時，蛋白酶的産生明顯減少，表明酵母膏和蛋白陳可能有協同作用。
為了确定不同成分對蛋白酶活性的影響，參考培養基在一個接一個的基礎上進行了富集。
所有測試的組分導緻比參考培養基更低的蛋白酶産量，在pH值為4、7和10時，尋求初始pH值對蛋白酶生産的影響。
這些結果表明，芽抱杆菌屬HTS102能夠在較寬的pH範圍内生長和釋放蛋白酶。
攪拌速度影響蛋白酶産率符合U型模式在進行的所有四項試驗中，培養物在50rpm水準搖動産生的蛋白酶活性低于任何其他測試速率。
令人驚訝的是，根本沒有攪拌産生極相似的效果，就像攪拌速度超過50轉。
蛋白酶活性在37°C時達到最大，而在30℃和55℃時獲得的活性顯著降低即分别為37°C時觀察到的活性的23%和25%。
影響最大的營養肉湯組分蛋白酶産率為牛肉提取物，然而堿性NB培養基的其他各組分對酶的産生起着一定的作用，因為它沿一次AP-proach的作用大大降低了酶的合成。
當酵母抽提物和NaCl同時從培養基中排出時，蛋白酶的産量進一步下降，表明naci盡管不是氮或碳的來源，proba-bly在保證蛋白酶合成的适當離子強度方面起着重要作用。
由于需要滿足分層條件，術語不能從模型中排除較高的整體F值發現表明，姿勢相關的模型提供了一個很好的配合，隻有0.17%的機會，這樣一個大的值發生由于純噪聲。
是以我們的實驗資料符合以下-降低雙因素互動作用模型方程:
其中Y是預測響應，是截距項PP是線性效應，B是互動效應，X和X是加工變量，為了确定導緻最大蛋白酶産量的每一個變量的水準通過表示蛋白酶活性相對于任何兩個自變量，建構了等高線圖。
在所研究的各種加工因素組合中，測定的蛋白酶活性在7.40和54.64U-之間相差很大。從基于2v分數因子設計的線性回歸分析結果來看，有一種形式是簡化的:
開發工業生物工藝的第一步是分離出一種能夠産生目标代謝物，并獲得足夠高産量的菌株這種方法需要密集的篩選。
是以需要對大量菌株進行試驗，以确定快速生産菌，甚至是可供選擇的有用代謝物有關細胞外微生物産品的正常實驗方法是使其在瓊脂平闆培養基上生長。
然後從産品區的半徑來評價産品的微生物能力這種政策在源頭殖民地周圍擴散開來，在其他地方也有詳細說明，當分離用于紡織工業中羊毛的新型改性的産蛋白酶細菌時。
由于堿性蛋白酶的經濟價值日益提高，對芽跑杆菌BacillussP，以胞外蛋白酶産量為目标函數，篩選HTS102，包括培養基組成和培養條件。
在分離出一個有前途的特性的菌株後，應該繼續優化代謝産物的合成和分泌，以使其工業應用盡可能有吸引力，回想一下，優化協定遵循這裡的結果-
通過了兩種順序的方法：第一，用總共24個因素進行的一組單因素實時實驗，以便将長清單減少到一個更小、更容易處理的關鍵因素清單。
第二，2v61分數階乘設計，隻測試6個更相關的關鍵因素的效果。
在進行了基于“單因素實時法”的綜合預篩選後，采用2V6分數因子設計對6個變量進行了進一步的測試。
酵母抽提物、蛋白酶、溫度和pH值最終在很大程度上影響了蛋白酶的産生，這一實驗方法在統計上證明是充分的并且有顯著的改進。
在測試的幾個碳源中，沒有一個比NB培養基配方的蛋白梅生産率更高。
是以表明培養基中其他成分的存在，而不是牛肉提取物，要麼抑制了蛋白酶的産生，要麼至少不能促進它的産生，而蛋白酶的合成降低了約93%的葡萄糖含量，可能是由于分解代謝抑制。
由于酵母抽提物和蛋白酶共同産生蛋白酶的結果表明了協同作用。
是以選擇了這兩種營養物質作為後續的優化步綠，pH7似乎是最适的，但作為一個重要的因素，作為一個重要的因素，也考慮了2v的分式階乘設計。
通過促進細胞獲得培養基中的營養物，同時避免抑制性産物濃度的積累，可以有利地有助于蛋白酶合成，然而，高攪拌速率也會導緻細胞破碎，這種困難可能超過上述攪拌的優點。
在高攪拌速率和完全不攪拌的情況下，蛋白酶生産得到的結果基本上是相似的。
這可能是由于氧氣供應量少和營養物質擷取的内在困難，由于攪拌是經濟可行的工業過程的一個重要因素，攬拌速率被選為一個因素進行。
雖然37℃似乎是最佳的，但很明顯溫度是蛋白酶生産的一個重要因素。
它被包括在2v6-部分因子設計，接種密度似乎對酶的生産水準有一定的影響，這無疑是工業規模擴大的一個重要參數，是以這一因素也被包括在後續的優化研究中。
在單因素實時分析單個NB組分的影響後，很難得出下一個優化步驟應該選擇哪些營養成分的結論。
是以通過四個獨立因素的架構析因設計，進一步研究了它們之間的互相作用，隻确定了其中要考慮的濃度範圍。
實驗是基于以前以NB培養基為中心點的篩選實驗的結果，每個實驗隻進行一次，通過芽抱杆菌對牛肉提取物和酵母提取物水準的反應，在蛋白酶生産方HTS102的依據是：
這個回歸方程有很好的拟合性，因為它的複相關系數是0.9695，回憶一下，大于0.75的值表示模型與實驗資料的拟合度可以接受。
該系數實際上是模型可以解釋的資料中總體變異的估計值，是以我們的模型能夠從統計學上解釋96.95%的響應變異，“調整後的R2”的值為0.9466，進一步證明了上述模型的顯著性，它與“預測的R”。
«——【·細胞外蛋白酶研究結果·】——»
因子之間的互相作用發生在當整體響應不同于它們的組合考慮是獨立的，可以很容易地解釋兩因素互動作用。
因為當一個因素的影響取決于另一個因素的水準時，它就會顯示出非平行線。
是以酵母抽提物與pH之間的互相作用證明是重要的，等高線圖是對所選因素的響應的二維表示，表面不對稱。
是以看不到峰值，是以顯然存在着進一步微調我們最終使用rsm模型預測的最優軌迹的空間。