最新全球癌症統計報告資料顯示，女性乳腺癌超過肺癌，成為全球第一大癌症，2020年大約新發230萬例，占全部新發癌症病例的11.7%[1]。
三陰性乳腺癌（TNBC）是指雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2表達均陰性的乳腺癌，占侵襲性乳腺癌的10%-20%。和其他亞型相比，TNBC具有侵襲性強，易轉移，預後差等特點，因其缺乏靶向受體，治療方案有限，使其成為臨床亟需攻克的難題[2，3]。
已有研究表明，鉑類藥物在TNBC新輔助化療和轉移性TNBC治療中顯示出良好的療效[4]。但鉑類藥物化療經濟成本高，副作用較大，部分患者對鉑類化療不敏感，延誤了治療時機。是以，探索有效的治療反應預測名額，篩選可能受益的TNBC亞組人群具有重要的臨床意義。
近年來，核仁小RNA（snoRNA）受到廣泛關注，研究表明，snoRNAs在外周血漿和血清中可穩定存在，易于富集和檢測，與惡性良性腫瘤的臨床病理特征和預後密切相關，可作為液體活檢的潛在生物标志物[5]。這無疑給研究人員帶來了新的研究思路和希望。
近日發現：血漿核仁小RNA SNORD33是鉑類藥物療效預測标志物，他們還揭示了SNORD33調控鉑類耐藥相關分子機制。相關研究成果線上發表于著名期刊Molecular Cancer上。
▲ 論文首頁截圖
接下來我們就一起來看看這個研究是如何開展的。
首先，研究人員建構了順鉑耐藥TNBC細胞株MDA-MB-231/DDP，其對順鉑的耐藥性是母代細胞株MDA-MB-231的5倍。通過RNA測序發現，共有277個RNA在MDA-MB-231/DDP細胞中異常表達，其中snoRNA的變異率最高（12.3%）。在所有變化的snoRNAs中，SNORD33的變化最大，降低最為顯著。
随後，研究人員在MDA-MB-231、MDA-MB-468和SUM149PT細胞中沉默SNORD33的表達後，進行了細胞實驗，探究SNORD33對TNBC細胞功能的影響。
結果顯示，SNORD33敲除後，乳腺癌細胞的增殖能力增強，凋亡細胞顯著減少。他們還在SNORD33敲除細胞中檢測到抗凋亡蛋白（Mcl-1和Bcl-2）水準顯著增加，促凋亡蛋白（活化caspase-3和caspase-9）表達降低。
以上研究表明，在順鉑耐藥的TNBC細胞中SNORD33表達顯著降低，下調SNORD33表達增強了TNBC細胞對順鉑的耐藥性。
▲ SNORD33對TNBC細胞生物功能的影響
231/DDP細胞對順鉑耐藥性增加（圖a）；熱圖分析顯示，與231細胞相比，231/DDP細胞中，snoRNAs表達存在差異（圖b），火山圖分析顯示，SNORD33的表達降低最為顯著（圖c）；SNORD33在231/DDP細胞中表達下調（圖d）；SNORD33敲除後，TNBC細胞順鉑耐藥性增加（圖e）
在體外細胞功能實驗中，SNORD33對TNBC細胞順鉑耐藥性的影響是顯而易見的，那麼SNORD33在TNBC患者血漿中的表達情況，及其與患者預後之間的關系又是如何呢？
首先，研究人員從三個臨床試驗中收集了255例mTNBC患者的血漿，其中一線化療方案不含鉑類藥物的45例，含鉑類藥物的209例（訓練隊列81例，驗證隊列128例，聯合隊列209例中有114例随機接受了BRCA 基因突變檢測）。
在訓練隊列中，根據血漿中SNORD33表達水準，将81個樣本分為SNORD33高表達組和SNORD33低表達組，這兩組之間的基線特征基本持平。分析發現，低SNORD33組的無進展生存期（PFS）明顯短于高SNORD33組（6.6個月vs10.1個月）。
在驗證隊列群組合隊列的分析結果與以上結論一緻：低SNORD33組的PFS顯著降低（驗證隊列：6.5vs10.1個月；聯合隊列：6.6vs10.1個月）。
在聯合隊列中，與高SNORD33組相比，低SNORD33組的總生存期（OS）顯著降低（22.2個月對40.6個月）。單因素Cox回歸分析顯示，SNORD33低表達、轉移竈數量、内髒轉移和肝轉移與PFS和OS降低顯著相關。在多因素分析中，SNORD33是鉑類化療PFS的獨立預測因素。
同時，在三個研究隊列中，達到臨床療效（CB）患者的血漿SNORD33顯著高于未達到CB的患者。
此外，接受非鉑類化療患者血漿SNORD33水準的變化與PFS無關。
以上研究結果表明，SNORD33表達水準的預測值具有鉑類藥物特異性。而目前研究最多的乳腺癌鉑敏感性生物标志物BRCA突變狀态，與血漿SNORD33水準無關，也與鉑類化療患者的PFS無關。
ROC分析發現，與其他單一臨床病理風險因素如肝轉移和轉移竈的數量相比，SNORD33血漿水準作為鉑類化療結果預測因子，具有更好的臨床應用價值（AUC = 0.652）。
最後，研究人員根據多因素Cox回歸模型中血漿SNORD33水準、肝轉移和轉移竈數量，繪制了預測含鉑方案PFS時間的列線陣圖，用于預測患者鉑類藥物治療不同時間臨床緩解可能性，預後列線圖所提供的這些資訊可以為臨床醫生選擇方案時提供重要的參考價值。
▲ mTNBC患者血漿中SNORD33的表達水準與相應預後之間的關系
患者的選擇和研究設計（圖f）；接受含鉑方案治療的mTNBC患者的中位無進展生存期（PFS）的與血漿中SNORD33的表達水準的關系，訓練隊列（圖g），驗證隊列（圖h）；接受非鉑方案治療的mTNBC患者的中位無進展生存期（PFS）的與血漿中SNORD33的表達水準的關系（圖i）；在達到臨床療效的患者中，血漿SNORD33水準顯著升高（圖j）；BRCA突變與血漿SNORD33水準無相關性（圖k）也與PFS無關（圖l）；與是否有肝轉移和轉移竈數量相比，血漿SNORD33對PFS的預測價值最高（圖m）；TNBC患者在鉑治療開始後發生PFS的機率（圖n）；列線圖的校準曲線（圖o）。
接下來，研究人員進一步探索了SNORD33影響鉑類耐藥的機制。
首先，研究人員通過RNA拉下試驗結合質譜分析，發現SNORD33通過阻止甲基化結合蛋白2（MeCP2）與甲基化CpG DNA的結合，來調節MeCP2靶向基因的表達。SNORD33表達下調可釋放MeCP2的轉錄抑制活性，進而抑制促凋亡基因的表達，惡性良性腫瘤細胞凋亡減少，增加三陰性乳腺癌細胞對鉑類的耐藥。
▲ 在MDA-MB-231細胞中，RPL13A、DICER酶或SNORD32a被敲除（圖a）；RPL13A、DICER酶或SNORD32a基因敲除不會改變細胞對鉑的耐藥性（圖b）；銀染條帶顯示實驗組和對照組條帶（圖c）；在MDA-MB-231細胞中進行RNA下拉和RIP（RNA免疫沉澱）分析（圖d）；MDA-MB-231細胞中SNORD33基因敲除不會改變MeCP2 mRNA和蛋白質水準（圖e）；在敲除SNORD33的MDA-MB-231細胞中，MeCP2靶基因的mRNA水準降低。（圖f）；SNORD33基因敲除促進MeCP2與下遊靶基因啟動子的結合（圖g）；SNORD33基因敲除不會改變共抑制因子mSIN3A和HDAC1與MeCP2的結合（圖i）。
随後，為了進一步證明以上結論，研究人員在SNORD33敲除的TNBC細胞系中敲除MeCP2後發現，MeCP2下調減弱了SNORD33基因敲除誘導的促凋亡蛋白減少和細胞凋亡，使抗凋亡蛋白表達增加，可部分逆轉TNBC細胞因SNORD33缺失而産生的鉑耐藥。
▲ MeCP2下調可部分逆轉SNORD33敲除誘導的細胞鉑耐藥（圖j）；流式細胞術測定順鉑處理細胞凋亡情況（圖k）；westernblot檢測順鉑處理細胞的凋亡相關蛋白的變化（圖l）
以上這些資料表明，SNORD33通過影響MeCP2與靶蛋白的結合調控凋亡相關基因的表達，進而影響細胞的凋亡，MeCP2被認為是SNORD33調控TNBC細胞鉑類耐藥的潛在靶點。
總的來說，在這個研究中，研究人員先是成功建構鉑類耐藥TNBC細胞株，通過RNA測序檢測表達異常的RNA，發現核仁小RNA，SNORD33；并且通過一系列研究，證明SNORD33與TNBC細胞對順鉑的耐藥密切相關，随後進一步探索了血漿SNORD33在mTNBC患者中的表達情況及其與患者預後之間的關系，并建構了預測含鉑方案PFS時間的列線圖。最後，他們還揭示了SNORD33影響鉑類耐藥的分子機制。整個過程環環相扣，這一研究為TNBC患者臨床結局的預測和臨床治療方案的選擇提供了高效、簡便，可靠的血漿标志物。
我們也期待SNORD33在新輔助化療及其它惡性良性腫瘤患者含鉑治療方案中的臨床研究，希望看到SNORD33能盡快應用于臨床治療，為惡性良性腫瘤患者帶來更多獲益。
參考文獻：
1.Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249. doi:10.3322/caac.21660
2.Perou CM, Sørlie T, Eisen MB, et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 2000;406(6797):747-752. doi:10.1038/35021093
3.Berrada N, Delaloge S, André F. Treatment of triple-negative metastatic breast cancer: toward individualized targeted treatments or chemosensitization?. Ann Oncol. 2010;21 Suppl 7:vii30-vii35. doi:10.1093/annonc/mdq279
4.Denkert C, Liedtke C, Tutt A, von Minckwitz G. Molecular alterations in triple-negative breast cancer-the road to new treatment strategies. Lancet. 2017;389(10087):2430-2442. doi:10.1016/S0140-6736(16)32454-0
5.Liao J, Yu L, Mei Y, et al. Small nucleolar RNA signatures as biomarkers for non-small-cell lung cancer. Mol Cancer. 2010;9:198. Published 2010 Jul 27. doi:10.1186/1476-4598-9-198